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临床研究
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代谢组学方法分析重症谵妄患者的血清代谢物
【摘要】 目的 基于磁共振代谢组学方法分析发生谵妄的重症患者血清代谢物标志物。方法 选 择2016年2月至2017年9月皖南医学院弋矶山医院重症医学科（ICU ）发生谵妄的患者18例（谵妄组），同时选择匹配的未发生谵妄的18例患者作为对照（非谵妄组）。采用磁共振（1H 磁共振）方法检测 2组患者血清代谢组学，主成分分析（PCA ）法进行多变量数据分析，偏最小二乘法-判别分析（PLS-DA ） 法进行模型验证，正交偏最小二乘法-判别分析（OPLS-DA ）筛选及鉴定2组患者间存在显著差异的代谢产物。结果 与非谵妄组患者相比，谵妄组患者的异亮氨酸、亮氨酸、缬氨酸、丙氨酸和乙酰乙酸的峰值明显增高，而柠檬酸的峰值则明显降低。结论 ICU 患者发生谵妄时，机体氨基酸代谢、三羧酸循环和酮体代谢异常，基于磁共振的代谢组学技术有助于发现谵妄患者差异标志代谢物。
【关键词】 重症监护病房； 谵妄； 代谢组； 磁共振波谱学
袁荆 鲁卫华 陈群 曹迎亚 王箴 姜小敢 吴敬医
DOI ：10.3877/ cma.j.issn.2096-1537.2019.02.009
基金项目：安徽省科技计划项目（1604f0804043）；安徽省高校学科（专业）拔尖人才学术资助项目（gxbjZD19）；安徽省学术和技术带头人后备人选科研资助项目（2017H145）
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作者单位：241001 安徽芜湖，皖南医学院弋矶山医院重症医学科通信作者：鲁卫华，Email ：
Magnetic resonance spectroscopy-bad plasma metabolomics study of delirium in critically ill patients Yuan Jing, Lu Weihua, Chen Qun, Cao Yingya, Wang Zhen, Jiang Xiaogan, Wu Jingyi. Department of Critical Care Medicine, Yijishan Hospital, Wannan Medical College, Wuhu 241001, China Corresponding author: Lu Weihua, Email:
【Abstract 】 Objective To conduct a metabonomics study of blood plasma from intensive care unit (ICU) patients with delirium bad on magnetic resonance spectroscopy (NMR). Methods Thirty-six ICU patients were lected prospectively from February 2016 to September 2017, and divided into either a delirium group or a non-delirium group, with 18 patients in each group. NMR was performed to analyze the difference in rum metabolomics between the two groups. Principal component analysis (PCA) was ud for multivariate data analysis, partial least-squares discriminant
analysis (PLS-DA) was ud for model validation, and orthogonal partial least-squares discriminant analysis (OPLS-DA) was ud to screen and identify metabolites with significant differences between the two groups. Results Metabonomics analysis indicated that plasma concentrations of valine, leucine, alanine, and acetoacetate in the delirium group were significantly incread compared with the non-delirium group, while plasma concentration of citrate significantly decread in the delirium group compared with the non-delirium group. Tho metabolites were associated with amino acid metabolism, tricarboxylic acid, and ketone body metabolism. Conclusions When delirium occurs in ICU patients, the body ′s amino acid metabolism, tricarboxylic acid circulation, and ketone body metabolism are abnormal. NMR-bad metabolomics technology can help identify different markers of metabolites in delirium patients.
【Key words 】 Intensive care unit; Delirium; Metabonome; Magnetic resonance spectroscopy
重症医学科（intensive care unit ，ICU ）谵妄是一种急性脑器质性精神障碍，以意识状态改变或反
复波动为主要特征，还包括精神运动异常、昼夜节
律紊乱、思维缺乏协调性和组织性、不能区别现实与想象的能力，常常产生幻视、幻听和妄想，又称 为ICU 综合征。该疾病的发病率为20%~80%［1］， 重症老年患者则更易发生谵妄［2］。研究表明，
ICU 患者合并谵妄的住院时间延长，医疗费用增加，病死率增加［3］。因此ICU 谵妄的防治，无论在提高医疗质量，还是在促进患者康复，提高远期生存质量等方面，都具有良好的经济和社会效益，已成
为临床一项亟需解决的问题。
谵妄作为ICU患者一种常见的并发症，可能是一种代谢性疾病［4］。ICU谵妄具体的发病机制尚不明确。大多数研究结果提示ICU内谵妄患者出现的认知功能障碍以及与之同时出现的脑电波慢活动是由于广泛的脑氧化代谢障碍所致［5］。任一能导致脑代谢物质在供给、摄取和利用方面发生障碍的因素，均能导致谵妄。代谢组学是后基因组时代的一个重要的研究领域，它从整体观点出发，系统地研究生物体内源性代谢产物的变化及其发展规律，能及时、全面地反映机体的变化信息［6］。代谢组研究的一个重要部分是找出疾病状态与健康状态下的小分子代谢物的表达差异，这一方面有利于人们为各类疾病的早期诊断寻找到生物标志物，另一方面还有利于人们对疾病预后和治疗效果的判断。研究ICU谵妄患者血清代谢组学的变化有助于了解谵妄的发生机制。近年来，代谢组学在多种疾病的研究中取得一定成果［7］。本研究采用磁共振代谢组学方法分析发生谵妄的重症患者血清代谢物标志物，为临床防治ICU谵妄和研究ICU谵妄的发病机制提供新的思路和理论依据。
资料与方法
一、对象
选择2016年2月至2017年9月皖南医学院弋矶山医院ICU收治的患者。纳入标准：（1）既往无神经系统疾病或器质性脑损伤；（2）无精神分裂症或者其他精神性的疾病史；（3）无精神药物成瘾史。精神性疾病的排除参考美国精神疾病诊断及分类手册第5版［8］，以头颅CT检查排除器质性的脑损伤。排除标准：（1）既往有神经系统疾病或器质性的脑损伤；（2）有精神分裂症或者有其他精神性疾病史；（3）精神药物成瘾史；（4）入院后处于深度镇静状态，即躁动-镇静评分量表（Richmond agitation-dation scale，RASS）评分为4分以下或持续处于昏迷状态；（5）患者在筛查完成之前死亡。所有患者ICU住院时间超过24 h。
最终18例经ICU意识模糊评估法（the confusion asssment method for the intensive care unit，CAM-ICU）诊断为谵妄的患者纳入本研究（谵妄组），同时按照1:1匹配的原则随机抽取同年龄段（相差不超过2岁）、相同疾病的18例患者作为对照（非谵妄组）。本研究经皖南医学院弋矶山医院伦理委员会批准，并获得患者的知情同意。
二、样本收集、制备及磁共振检测
由接受过ICU谵妄评估培训的护理人员用采用CAM-ICU法对患者进行谵妄的评估。自患者入ICU第1天起，每天评估患者2次，直至入ICU 第5天或转出ICU。在谵妄确诊当天抽取谵妄组患者静脉血2 ml，
并同期抽取非谵妄患者等量血液标本，置于肝素抗凝管中，于4℃低温3000 r/min （16 099×g）离心15 min分离血浆，取上清液于PVC管中，置于-80℃低温保存。
取血清样本200 μl于1.5 ml EP管中，加入400 μl缓冲液（4.3 mmol/L NaH
2
PO
4
/1.4 mmol/L
K
2
HPO
4
，pH 7.4，100% D
2
O），振荡混匀后离心（4℃，16 099×g，10 min），取550 μl上清液至5 mm核磁管中待检。采用Agilent DD 2 600 MHz核磁共振谱仪（质子的共振频率为599.83 MHz，配备超低温探头）进行1H磁共振实验。采用有预饱和压水的1D CPMG脉冲序列，分别检测各个样本的小分子代谢物成分。采用磁共振技术对所有样本进行检测分析后，分别对谵妄组-非谵妄组配对进行代谢组学多变量数据统计分析。其中包括：数据预处理，主成分分析（principal component analysis，PCA），偏最小二乘法-判别分析（partial least squares discrimination analysis，PLS-DA），正交偏最小二乘法-判别分析（orthogonal partial least squares discriminant analysis，OPLS-DA），差异代谢物筛选和差异代谢物鉴定。
1. 数据预处理：对采集的所有一维1H磁共振谱图的FID信号加上增宽因子为1 Hz的指数窗函数后进行傅立叶变换以提高信噪比，然后手动进行相位和基线校正，所有样品的核磁共振谱图采用α-葡萄糖低场处的双峰定标（δ 5.23）。利用相关软件将核磁共振谱图进行积分，参数如下：积分区间为9.0~0.5 ppm，积分间距为0.002 ppm，去掉水峰（5.17~4.53 ppm）。将积分后的数据归一化后进行多变量数据统计分析。
2. PCA：使用SIMCA-P＋软件（V11.0，Umetrics AB，Umea，Sweden）对归一化后的数据进行模式识别多变量数据分析，PCA使用中心化换算（mean center scaling）的数据标准化方式。
3. PLS-DA及模型验证：使用SIMCA-P＋软件对归一化后的数据进行PLS发现磁共振数据（X变量）和其他变量（Y变量，分组信息）之间的相关关系。PLS-DA使用自适换算（unit variance
scaling）的数据标准化方式。PLS-DA对模型的质量用交叉验证法进行检验，并用交叉验证后得到的R2X和Q2（分别代表模型可解释的变量和模型的可预测度）对模型有效性进行评判。在此之后，通过排列试验随机多次（n=999）改变分类变量Y的排列顺序得到相应不同的随机Q2值对模型有效性做进一步的检验。
4. OPLS-DA：对PLS-DA模型进行正交信号矫正，使用SIMCA-P＋软件进行OPLS-DA，最大化地突显模型内部不同组别之间的差异。OPLS-DA 使用自适换算的数据标准化方式。谱库检索对差异代谢物进行筛选及鉴定。
三、统计学分析
采用SPSS 18.0统计学软件进行统计学分析。患者年龄、急性生理与慢性健康（acute physiology and chronic health evaluation，APACHE Ⅱ）评分经统计学分析均符合正态分布，以x±s表示。采用独立样本t检验比较2组患者年龄、APACHE Ⅱ评分差异。采用χ2检验比较2组患者性别差异。采用PCA软件进行多元统计分析。以P＜0.05为差异具有统计学意义。
结 果
一、2组患者一般资料比较
2组患者年龄、性别、APACHE Ⅱ评分差异均无统计学意义（表1），具有可比性。
表1 2组患者一般资料比较
组别例数
年龄
（岁，x±s）
性别
（例，男性/女性）
APACHE Ⅱ评分
（分，x±s）
谵妄组1862.4±22.912/615.0±6.0非谵妄组1866.4±19.314/414.2±7.2统计值t=0.577χ2=0.554t=-0.777 P值0.5680.4570.438 注：APACHE
Ⅱ评分为急性生理与慢性健康评分注：Phenylalanine为苯丙氨酸；Histidine为组氨酸；
面相痣
Urea为尿素氮；α-Gluco为α-葡萄糖；β-Gluco 为β-葡萄糖；Lactate为乳酸；Gluco为葡萄糖；Choline为胆碱；Crea为肌酸；Citrate为柠檬酸盐；Glu为谷氨酸；Acetate为醋酸盐；Val为缬氨酸；Formate为甲酸盐；Hislidine为组氨酸；Tyrosine 为络氨酸；TG为甘油三酯；Residual H
2
江南行
O为残留的水；Glycine为甘氨酸；PC为磷酸胆碱；GPC 为甘油磷酸胆碱；Pyruvate为丙酮酸；Aceto
acetate 为乙酰乙酸；NAG为N-乙酰糖蛋白信号；Lys为赖氨酸；Arg为精氨酸；Alanine：丙氨酸；3-HB 为3-羟基丁酸；Leu为亮氨酸；Ile为异亮氨酸；
L1为CH3-（CH2）
n
-；L2：CH3-（CH2）
n
-；L3为
CH3-（CH2）
n
-；L4为-CH2-CH2-C=O；L5为-CH2-CH2-C=C；L6为-CH2-C=C；L7为-CH2-C= O；L8为CH=CH-CH2-CH=CH；L9为-CH=CH-图1 各组代表性样品的1H 600 MHz
核磁共振图谱
注：方块表示非谵妄组；实心圆表示谵妄组
图2 谵妄组与非谵妄组患者主成分分析
二、2组患者血清代谢组学分析
1. 1H磁共振谱图：选择各组中具有代表性谱图，根据一维谱图并结合公共数据库对核磁共振信号进行归属。图1显示不同内源性代谢物在血液中的化学结构和浓度的存在差异，其相应色谱峰响应值也差
异较大。
高超的近义词2. PCA：经过PCA处理后，前2个相互正交的主成分PC1、PC2能够体现原数据集中的3
3.3%和预测原数据集中17.5%的方差（RX=33.3%，Q=17.5%）。图2标注了样品类别的PCA得分图（每一个点表示一个对应的样本，去除异常点），在得分图上非谵妄组与谵妄组可明显区分开来，提示谵妄是造成机体的代谢发生变化的主要影响因素。
3. PLS-DA及模型验证：为了验证PCA模型的可靠性，本研究进一步采用PLS-DA进行模型验证。经过验证，该模型的可解释的指标代谢产物和可预
妄组患者存在显著性差异的代谢物异亮氨酸、亮氨酸、缬氨酸、丙氨酸、乙酰乙酸和柠檬酸进行鉴定，其相应的相关系数分别为0.622、0.578、0.612、0.567、0.575、-0.646。谵妄组与非谵妄组患者差异代谢物包括异亮氨酸、亮氨酸、缬氨酸、丙氨酸、乙酰乙酸和柠檬酸，涉及氨基酸代谢、三羧酸循环和酮体代谢等代谢途径。
讨 论
代谢组是指一个细胞、组织或器官中所有代谢产物的集合，它包含一系列不同类型的分子，除了有糖类、脂类、核酸、肽，还有异源物质的催化产物。针对代谢组的分析不仅可以提示生物体内各器官的
生化状态，而且还可以为新基因或未知基因的功能阐述提供支持，此外，它还可以提示生物体内各代谢网络间的相互关联性，以助人们更系统、更全面
地认识生物体［9］。目前代谢组学可用于先天性疾病、
感染性疾病、心血管疾病等疾病的诊断［10］。人体中含有诸多内源性代谢物信息，这些信息多而复杂，儿童乐园项目
要提取这些信息，就需要采用先进的检测技术。基于磁共振的代谢组学研究是通过生物体液（血液、尿液以及组织提取液等）的磁共振分析，测定其中的内源性代谢产物，再利用模式识别将代谢物的变化与生物的生理活动联系起来。
代谢组学技术具有独特的优势，通过检测代谢物的改变可直观地反映疾病对机体造成的影响。近年来关于代谢组学的研究越来越受到人们的青睐，其主要体现在对疾病诊断、发病机制及治疗等方面。本研究采用磁共振的代谢组学检测技术，对谵妄组和非谵妄组患者血清样本进行分析，研究发现谵妄组和非谵妄组患者的代谢组存在一定的差异。这些差异代谢物包括异亮氨酸、亮氨酸、缬氨酸、丙氨
酸、乙酰乙酸和柠檬酸，涉及氨基酸代谢、三羧酸
图3 谵妄组与非谵妄组患者偏最小二乘法-判别分析得分图（a ）与排列试验验证结果（b ）。图a 中方块为谵妄组，实心圆为非谵妄组；图b 中三角
形为R 2，方块为Q 2
测指标谵妄提示本研究所建立的数学模型较可靠， 说明2组患者间代谢组学存在一定的差异（图3
）。折线统计图教案
图4 谵妄组与非谵妄组的正交偏最小二乘法-判别分析得分图（a ）与相关系数负载图（b ）。图a 中方块为谵妄组，实心圆为非谵妄组；图b 中Acet 为乙酰乙酸；Citr 为柠檬酸；Ala 为丙氨酸；Val 为缬氨酸；Ile 为
异亮氨酸；Leu 为亮氨酸
4. OPLS-DA ：进一步利用OPLS-DA 得分图将2组患者完全区分开来，在相关系数的负载图中，列出了所有与样品分类有关的变量，其中有6个变量的回归系数的绝对值超过Hotelling T2统计量阈值，表明这6个变量在组间的差异有统计学意义（P ＜0.05）（图4）。经鉴定，上述6个标志物分别是异亮氨酸、亮氨酸、缬氨酸、丙氨酸、乙酰乙酸和柠檬酸。
5. 差异代谢物的筛选及鉴定：将非谵妄组与谵
循环和酮体代谢等代谢途径。乙酰乙酸、柠檬酸涉及体内的有氧代谢，柠檬酸的减少表明有氧代谢的减弱，有研究指出低氧血症是ICU患者发生谵妄的危险因素［11］，低氧血症时脑能量代谢方式发生改变，缺氧导致无氧糖酵解代谢増加，导致谵妄的发生。各种因素导致血中增多的中性氨基酸（如酪氨酸、苯丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸等）通过血脑屏障，与色氨酸竞争L型氨基酸转运载体，导致中枢神经系统对色氨酸和苯丙氨酸重摄取增多，引起多巴胺以及去甲肾上腺素增多，从而导致谵妄的发生［12］。脑内糖酵解反应受儿茶酚胺神经递质的调节，星形胶质细胞分布有肾上腺素能受体，可通过第二信使信号通路对葡萄萄转运、糖酵解、氧代谢、糖原合成及降解、谷氨酸盐摄取、谷氨酰胺水解等活动进行调节［10］。
Paige等［13］利用代谢组学的方法研究老年抑郁症，其结果表明老年抑郁症可能与神经递质、脂类
等的代谢改变有关。另有研究利用酶联免疫吸附的方法测定血液中代谢物的变化与谵妄发生的关系，试图找出谵妄发生的危险因素。如有学者指出褪黑素昼夜分泌节律的紊乱是导致重症患者谵妄发生的危险因素之一［14］。尽管上述研究未采用代谢组学的方法，但其中涉及的代谢产物的改变为以后的基础和临床研究谵妄发生的病理生理机制指明了方向。因此本研究发现谵妄组与非谵妄组患者代谢物水平的差异可能为阐明谵妄发生的病理生理机制提供有力的基础数据支持。
本研究采用病例对照的方法，通过匹配设计选择2组患者，其不足之处在于病例数相对较少，而导致重症患者谵妄的因素有很多，为了减少混杂因素的影响采用以下2种控制方法：（1）限制。设计时对研究对象的入选条件进行限制，如疾病的主要诊断；（2）匹配。将对结果有干扰的某些因素或特征作为配比因素，如性别、年龄等，使谵妄组和非谵妄组患者在配比因素上保持相同。
鸭嘴鲟综上所述，危重患者发生谵妄时，其血清差异代谢物包括异亮氨酸、亮氨酸、缬氨酸、丙氨酸、乙酰乙酸和柠檬酸，涉及氨基酸代谢、三羧酸循环和酮体代谢等代谢途径。利用基于磁共振的代谢组学技术可发现谵妄患者血清标志物，有助于早期发现ICU谵妄，并为谵妄治疗的研究提供新的思路。
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（本文编辑：卫轲）
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