结直肠癌KRAS和BRAF基因突变及其与临床病理的相关性
谢明智;李科志;利基林;蔡政民;胡榜利
【摘 要】目的 探讨结直肠癌患者KRAS和BRAF基因突变与临床病理特征的关系.方法 应用实时荧光TaqMan探针法检测322例结直肠癌患者KRAS和BRAF基因突变情况,分析患者不同年龄、性别、肿瘤大小、分化程度等不同组别的基因突变情况与临床病理特征的关系.结果 322例结直肠癌患者中,结肠癌患者182例,直肠癌患者140例,KRAS基因突变105例(32.6％),BRAF基因突变13例(4.0％).结肠癌患者和直肠癌患者在性别、年龄、肿瘤分化程度、淋巴结转移、远处转移、肿瘤分期指标比较差异无统计学意义(P＞0.05);但结肠癌患者T3 +T4的比例高于直肠癌患者(P=0.004).结肠癌和直肠癌患者KRAS和BRAF基因突变情况比较差异无统计学意义(P＞0.05).在105例KRAS基因突变中,G12D突变40例(38.1％),G12S突变38例(36.2％),G12A突变12例(11.4％),G12V突变9例(8.6％),Gl3A突变6例(5.7％).13例BRAF基因突变型均为V600E型.右半结肠癌的KRAS基因突变率显著高于左半结肠癌和直肠癌(P=0.010);BRAF基因突变的患者年龄高于未突变者(P =0.022),突变患者发生淋巴结转移的比例比未发生转移的比例低(P =0.020);突变患者Ⅲ+Ⅳ期的比例低于未突变患者(P =0.044).结论
结直肠癌患者存在较高的KRAS基因突变率,而BRAF基因突变率较低.KRAS基因突变与肿瘤的原发部位密切相关,且与BRAF基因突变无直接相关性.
【期刊名称】《广东医学》
【年(卷),期】2019(040)008
【总页数】4页(P1128-1131)
【关键词】结直肠肿瘤;KRAS;BRAF;基因突变
【作 者】谢明智;李科志;利基林;蔡政民;胡榜利素描眼睛图片
【作者单位】广西医科大学附属肿瘤医院实验研究部 广西南宁530021;广西医科大学附属肿瘤医院实验研究部 广西南宁530021;广西医科大学附属肿瘤医院实验研究部 广西南宁530021;广西医科大学附属肿瘤医院实验研究部 广西南宁530021;广西医科大学附属肿瘤医院实验研究部 广西南宁530021
【正文语种】中 文
【中图分类】R735.3;R394.3
疑病症怎么治疗结直肠癌是消化系统最常见的肿瘤之一，除了手术治疗外，肿瘤靶向治疗成为结直肠癌的重要治疗方式，其中抗表皮生长因子受体(EGFR)是目前治疗转移性结直肠癌的主要靶向药物[1]。然而EGFR的治疗效果与KRAS和BRAF基因突变密切相关。KRAS基因野生型患者对于EGFR治疗较为敏感，而KRAS基因突变型者治疗效果较差[2]。若检测无KRAS基因突变，还需要检测BRAF的突变情况，如果BRAF基因发生突变，则EGFR的疗效将显著降低[3]。因此，明确KRAS和BRAF基因突变情况对于指导结直肠癌的治疗具有重要的临床意义。本研究回顾性分析我院结直肠癌患者KRAS和BRAF基因突变及其与临床病理特征的关系，以期为患者制定临床个体化治疗方案提供参考。
1 资料与方法
清明时节雨1.1 一般资料 收集广西医科大学附属肿瘤医院2015年1月至2017年12月之间的结直肠癌患者322例的临床资料，提取患者的性别、年龄、肿瘤原发部位、分化程度、肿瘤临床分期、肿瘤浸润深度、有无淋巴结转移以及有无肿瘤远处转移等。手术切除标本均经病理证实为肿瘤，获取新鲜肿瘤组织后，均使用4%甲醛固定石蜡包埋。KRAS基因突变检测指标
包括第二外显子 (G12S、G12D、G12C、G12V、G12A、G12R、G13D)，第四外显子(K117N、A146T、A146V、A146P)，第三外显子(Q61H)基因突变，BRAF基因突变检测指标为第十五外显子(V600E)。
雷鬼舞1.2 检测方法
1.2.1 基因组DNA抽提 采用Qiagen公司(德国)的DNA提取试剂盒(QIAamp DNA Mini Kit)抽提组织DNA，常规切片4 μm厚5～10张，脱蜡、水化。选取l张HE染色进行病理学评估，其余组织用于提取DNA。首先在显微镜下观察HE切片，选取富于肿瘤细胞的区域(肿瘤成分>80%)，标记处肿瘤部位，以此张切片为标准，将其他切片对应部位的肿瘤组织刮入EP管中，常规脱蜡处理，用 QIAGEN 公司 QIAAMP DNA FFPE Tissue KIT 提取石蜡切片组织中基因组，对提取的DNA进行质量控制，质控合格的样品DNA放置-20℃冰箱进行保存。
1.2.2 TaqMan探针法 运使用人类 KRAS/NRAS/BRAF基因突变联合检测试剂盒(ARMS 法) 进行基因突变分析，总反应体系均为40 μL，其中包括模板DNA 5 μL，反应混合液35 μL；每次反应均设置阳性、阴性对照及外控。所有的反应试剂均由此试剂盒提供。反应循环参
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数: 第一阶段:95℃ 5 min，1个循环；第二阶段:95℃ 25 s，64℃ 20 s，72℃ 20 s，15个循环；第三阶段：93℃ 25 s，60℃ 35 s，72℃ 20 s，31个循环；信号收集：第三阶段60℃时收集FAM和HEX(或VIC)信号，执行实时PCR。反应结束后自动调整基线和阈值即可得到各样本的突变Ct值，最后根据说明书判读KRAS和BRAF基因突变情况。
1.3 统计学方法 观察数据采用SPSS 20.0统计软件分析，计量资料比较采用t检验，计数资料比较采用2检验，不满足2检验条件的用Fisher精确概率法计算。以P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 结直肠癌临床病理参数分析 在322例结直肠癌患者中，结肠癌患者182例，直肠癌患者140例，KRAS基因突变105例(32.6%)，BRAF基因突变13例(4.0%)。以结肠癌和直肠癌为分组进行比较，结果显示结肠癌患者和直肠癌患者在性别、年龄、肿瘤分化程度、淋巴结转移、远处转移、肿瘤分期的临床指标比较，差异无统计学意义(P>0.05)；但肿瘤浸润深度方面，结肠癌患者T3+T4的比例(88.5%)高于直肠癌患者(76.4%)(P=0.004)。结肠癌和直肠癌患者KRAS和BRAF基因突变情况比较差异无统计学意义(P>0.05)。见表1。
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2.2 KRAS和BRAF基因突变的类型和频率 在105例KRAS基因突变中，G12D突变40例(38.1%)，G12S突变38例(36.2%)， G12A突变12例(11.4%)，G12V突变9例(8.6%)，G13A突变6例(5.7%)。13例BRAF基因突变型均为V600E型。未发现KRAS基因突变合并BRAF基因突变的患者。
2.3 KRAS和BRAF基因突变与临床病理参数关系 根据KRAS和BRAF基因突变进行分组，结果显示KRAS基因在不同患者的性别、年龄、肿瘤分化程度、淋巴结转移、远处转移、肿瘤分期差异无统计学意义(P>0.05)，但与结肠癌发生部位存在密切关系，即右半结肠癌的KRAS基因突变率(47.2%，34/72)显著高于左半结肠癌(27.3%，30/110)和直肠癌(29.3%，41/140)(P=0.010)。
BRAF基因突变方面，BRAF基因突变在不同性别、肿瘤分化程度、远处转移、肿瘤部位差异无统计学意义(P>0.05)；但发生BRAF基因突变的患者年龄高于未突变者(P=0.022)，突变患者发生淋巴结转移的比例(60.2%，186/309)比未发生转移的比例低(92.3%，12/13)(P=0.020)；突变患者Ⅲ+Ⅳ期的比例(65.4%，202/309)低于未突变患者(92.3%，12/13)(P=0.044)。见表2。
表1 结直肠癌临床病理参数分析 例项目结肠癌直肠癌2/t值P值性别0.1320.716 男12095 女6245年龄[(x±s)岁]57.9±12.359.9±13.51.5200.129分化程度4.2090.122 低分化3421 高分化71 中分化141118浸润深度8.2090.004 T1+T22133 T3+T4161107淋巴结转移2.6800.102 N06361 N1+N211979远处转移4.3050.038 M0114103 M16837肿瘤分期2.8130.094 Ⅰ+Ⅱ5454 Ⅲ+Ⅳ12886KRAS基因1.2450.265 突变6441 未突变11899BRAF基因2.2940.130 突变103 未突变172137现在流行什么发型
3 讨论
结直肠癌的发病是一个在多种因素作用下基因不断突变导致细胞异常增殖的过程。近年来，随着精准医疗的发展，结直肠癌的治疗也进入了靶向治疗的时代。目前EGFR 基因是临床上治疗结直肠癌的主要靶点之一，然而该EGFR靶向治疗的效果受很多因素的影响，其中KRAS和BRAF基因是否突变与EGFR靶向治疗密切相关[4]。KRAS和BRAF基因野生型患者可从抗EGFR治疗中获益，突变型患者疗效很差[2-3]，因此治疗靶点的检测是临床进行个体化治疗的前提。
KRAS基因突变是恶性肿瘤的基因突变的最常见类型之一[5]。KRAS基因突变可见于各种实
体瘤的发病过程。目前已经在60%～90%的胰腺癌，35%的结肠直肠癌，20%的浆液性卵巢癌和15%的甲状腺癌中检测出存在KRAS基因突变[6]。105例KRAS基因突变中G12D突变率为26.25%，G12V突变率为4.17%，G12C突变率为2.50%，G12S突变率为2.08%，G12A突变率为1.67%，G13D突变率为3.33%[7]。结肠癌患者基因突变率受研究样本量大小、检测方法及人种差异的影响而存在不一致的结果。KRAS基因突变率在30%～43.8%范围内[8-10]，本研究中KRAS基因的突变率为43.1%，结果与既往的文献报道相符。多项研究报道了KRAS基因突变与结直肠癌临床病理参数的关系，但这些结果存在较大的差异。本研究仅发现KRAS基因突变与肿瘤部位存在显著差异，而且右半结肠癌的突变率最高，这个结果也可以部分解释不同部位的结肠直肠癌生存率存在明显差异[11]。
表2 KRAS和BRAF基因突变与临床病理参数关系 例项目KRAS基因BRAF基因突变未突变2/t值P值突变未突变2/t值P值性别1.0750.3000.0370.848 男66149 2069 女39681034年龄[(x±s)岁]58.3±11.759.2±11.90.5430.43759.3±12.150.9±8.92.5880.022分化程度0.0910.9553.5660.168 低分化1837514 高分化3571 中分化841752518浸润深度0.6890.4060.0190.891 T1+T21539522 T3+T49017825711淋巴结转移0.7590.3845.4330.020 N044801231 N16113718612远处转移0.0370.8471.1310.288 M07
01472107 M13570996肿瘤分期0.0390.8444.0600.044 Ⅰ+Ⅱ36721071 Ⅲ+Ⅳ6914520212肿瘤部位9.1260.0102.8370.242 左半30801037 右半3438693 直肠41991373
