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中日友好医院学报 2021 年第 35 卷第 1 期 Journal of China-Japan Friendship Hospital ,2021 Feb , Vol.35,No.l
乳腺癌患者循环肿瘤细胞 阳性率与预后的关系
张 洁，杨 猛，彭维朝，陈 平，鲁瑶，马宏光，黄林平*
*基金项目：中日友好医院院级课题面上项目(2013-MS-06)* 本文通讯作者，E-mail : hlpsurgeon@l 26.com
梦到掉牙作者简介：张 洁(1985-)，女，主治医师，医学博士。收稿日期:2020-11-13修回日期：2020-12-14
(中日友好医院普外科，北京 100029)
摘要目的：探讨乳腺癌患者外周血循环肿瘤细胞(CTC)检测阳性率与原发肿瘤临床病理特征及预后的关系。 方法：前瞻性收集41例乳腺癌患者术前外周血，密度梯度离心进行CTC 富集，甲苯胺蓝染色，CK 联合上皮黏 附分子免疫细胞化学法鉴定CTC ：采用；t 2检验分析CTC 阳性率与临床病理特征及预后的关系。结果：乳腺癌外
周血CTC 阳性率与分子分型、原发肿瘤T 分期及TNM 分期具有明显相关性(均&0.05)。与年龄、激素受体、 Ki67、Her-2表达、淋巴结、远处转移无显著相关性(均P>0.05)o 平均随访75.9±2.59个月，CTC 阳性组与CTC 阴性组在远处转移及死亡发生率方面均无显著性差异(民0.555)。结论：乳腺癌外周血CTC 的检测具有显著临
床意义。
关 键 词：乳腺癌；循环肿瘤细胞；上皮黏附分子；TNM 分期
中图分类号:R737.9 文献标识码：A 文章编号：1001 -0025(2021)01 -0024-04
doi : 10.3969/j.issn .1001-0025.2021.01.006
Detection of circulating tumor cells in breast cancer patients and its relationship with clinical progno-
sis//ZHANG Jie,YANG Meng,PENG Wei-chao,et al//Journal of China-Japan Friendship Hospital,2021 Feb,35(1):24-27
Abstract Objective ： To investigate the relationship between the detection of circulating tumor cells (CTCs)and
clinicopathological features of breast cancer patients as well as their prognosis.Methods : Preoperative peripheral blood samples of 41 patients suffering from breast cancer were collected prospectively.CTCs were enriched by
density gradient centrifugation, stained with toluidine blue , and identified by CK combining with EpCAM im
munocytochemistry.The relationship between the positive rate of CTCs and clinicopathological features of the patients and their prognosis were analyzed by chi square test.Results ： The positive rate of CTCs in peripheral blood circulation of breast cancer patients was significantly correlated with their molecular classifications , pri
mary tumor T staging and TNM subgroup staging (P<0.05).There was no significant correlation with age ,hor
mone receptor status,Ki-67 level,HER-2 expression ,lymph node and distant metastasis (P>0.05).The average follow-up was 75.9±2.59 months.There was no significant difference in the incidence of distant metastasis and death between CTC positive group and CTC negative group (P=0.555) .Conclusion : The detection of CTCs in
peripheral blood circulation of breast cancer patients has significant clinical significance.
Key words breast cancer ；circulating tumor cells ；epithelial cell adhesion molecule ；TNM staging
Author's address Department of General Surgeiy ,China-Japan Friendship Hospital ,Beijing 100029,China
乳腺癌是女性最常见的恶性肿瘤，美国2020 年预计新发乳腺癌27640例，高居所有女性恶性 肿瘤第一位；预计死于乳腺癌的女性患者42170
例，位于女性所有恶性肿瘤死因第2位叭 在我国 乳腺癌的发病率和死亡率也逐年上升叫循环肿瘤
细胞(circulating tumor cells,CTCs)是可在肿瘤患
者外周血中检测到。研究表明,CTCs 检测对乳腺
癌预后判断、治疗效果评价及复发监测具有重要 意义讥我们前瞻性收集了原发性乳腺癌外周血标
本，利用密度梯度离心富集及上皮标记物细胞角 蛋白(pan-cytokeratin ,CK)联合上皮黏附分子(ep-
ithelial cell adhesion molecule , Ep-CAM )免疫细
胞化学方法检测CTCs，以探讨乳腺癌外周血
Journal of China-Japan Friendship Hospital,2021Feb,Vol.35,No.1中日友好医院学报2021年第35卷第1期25
CTCs阳性率与原发肿瘤临床病理特征及预后的关系。
1资料与方法
1.1标本来源及患者临床资料
前瞻性收集中日友好医院普外科2014年1月~8月收治的乳腺癌患者术前外周血样本41份，米集每名受试者清晨空腹外周血10mlo患者年龄28-84岁，中位年龄53岁；M53岁的22例(53.7%),<53岁的19例(46.3%)。
如何开拓市场
组织病理类型为浸润性导管癌32例，其他类型者9例。根据美国癌症联合会2017年第八版乳腺癌分期标准对患者行TNM分期。所有入组患者均进行电话随访。
1.2密度梯度离心法富集CTC
将PBS及人淋巴细胞分离液(Ficoll Paque™Plus,GE Healthcare)从冰箱取出放置在室温预热。将含EDTA抗凝管收集的乳腺癌患者外周血10ml加入到等体积淋巴细胞分离液中,1500r/min 离心20min，吸取中间有核细胞层，加入PBS洗涤，并再次离心，弃去上清液，加入蒸懈水洗涤并离心2次，弃去上清液，向白色沉淀中加入PBS 200山，并将细胞悬浮，制作细胞涂片20张，自然风干后，用中性福尔马林固定15min,4七保存备用。
1.3CTC检测
1.3.1甲苯胺蓝染色
吸取甲苯胺蓝染色液100口覆盖已固定CTC 玻片标本，自来水流水冲洗，除去浮色。由同一检验员显微镜下读片。
1.3.2免疫细胞化学法检测CTC
将已固定CTC玻片浸入0.3%过氧化氢溶液中氧化15min，阻断内源性过氧化物酶。用0.01M PBS洗涤5min、3次，孵育一抗(鼠抗人pan-CK 抗体1：200，兔抗人EPcam抗体1：100),4%：过夜。0.01MPBS洗涤5min、3次，二抗(DAKO A 液)孵育l~3h,0.01M PBS洗涤5min、3次。然后利用即用型DAB液显色，显微镜下控制显色时间,0.01M PBS终止显色。Meyer苏木素复染细胞核lmin，流水冲走浮色。梯度酒精各脱水2min，二甲苯透明lOmin，中性树胶圭寸片。由同一检验员显微镜下读片。
1.4原发性肿瘤的免疫组化检测结果的判读
(1)雌激素受体(ER)和孕激素受体(PR)：M 1%癌细胞核着色；ER和(或)PR(+)定义为激素受体(+)。(2)Ki67：计数1000个癌细胞中细胞核着色的百分数，<15%定义为低表达，工15%为高表1乳腺癌患者外周血CTC与临床病理因素的关系临床
病理因素
n
循环肿瘤细胞
r P值
阳性W阴性5)
年龄0.4310.511 M53岁22166
<53岁19127
ER0.6660.415阳性33249
阴性844
PR 2.7650.096阳性33258
阴性835
Ki67 2.9380.23 <14%14113
M14%26179
Her-2状态0.4120.521阳性761
阴性342212
分子分型&0270.045
* Luminal A1091
人工智能导论Luminal B25178
Her2过表达110
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Basal-like514
淮盐
原发肿瘤分期9.9660.006
* Tis+Tl1679
T214104
T3+T411110
淋巴结病理分期 3.2850.203 NO20128
N1+N215105
N3660
远处转移 1.5030.539 M0382513
Ml330
TNM分期7.2240.027
* I1578
n1284
皿+IV14131
注：*P<0.05
26中日友好医院学报2021年第35卷第1期Journal of China-Japan Friendship Hospital,2021 Feb,Vol.35、No.l
表达。（3）HER-2：癌细胞中细胞膜无着色为（0）；任何比例的癌细胞显示弱的、不完整的细胞膜着色，或<10%的癌细胞显示弱的、完整的细胞膜着色为（+）；N10%的癌细胞显示弱的或中度的完整细胞膜着色，或<30%的癌细胞显示一致的、强的、完整的细胞膜着色为（++）；M30%的癌细胞显示一致的、强的、完整的细胞膜着色为（+++）。（0）或者（+）定义为阴性；（+++）定义为阳性；（++）为不确定状态，均行荧光原位杂交技术检测进一步明确HER-2状态。
1.5统计学方法
应用SPSS17.0软件进行统计学分析。计量资料采用G±s）表示。计数资料组间比较采用才检验或者Fisher精确概率法。
2结果
2.1乳腺癌患者外周血CTCs的鉴定
利用甲苯胺蓝染色及上皮细胞标记物细胞角蛋白（CK）及上皮黏附分子（Ep-CA M）检测到了乳腺癌患者外周血中循环肿瘤细胞的存在。甲苯胺蓝染色显示细胞核蓝染，可见细胞核增大的CTCs （见图1A箭头所示，封三）。进一步利用上皮细胞标记物进行免疫细胞化学法证实，结果显示CK 染色阳性（图1B，见封三）以及Ep-CAM染色阳性（图1C，见封三）的即为CTCs o
2.2CTC与原发性乳腺癌临床特点的关系
表1示，乳腺癌患者外周血CTC阳性率在不同乳腺癌分子分型、原发肿瘤分期（T）及TNM分期亚组之间具有显著性差异（均P<0.05）o而在不同患者年龄、雌激素受体（ER）、孕激素受体（PR）、Ki67、Her-2表达、淋巴结分期（N）、远处转移（M）亚组间无显著性差异（均Q0.05）。
失访6例，其它患者随访时间73-80个月，平均75.9+2.59个月。CTC阳性组与CTC阴性组在远处转移及死亡发生率方面差异无统计学意义（P=0.555）（见表1）。CTC阳性组在随访期间发生骨转移1例、肺转移2例、死亡2例。CTC阴性组在随访期间发生骨转移1例、死亡1例，死于化疗副作用。
3讨论
CTCs是指自发或因诊疗操作由原发部位进入外周血循环的肿瘤细胞，并在一定条件下可发展为转移灶。于1896年由澳大利亚的Ashworth 首次提出。血液中CTCs的存在与肿瘤的微转移密切相关同，已在肺冋、结肠同等不同实体肿瘤中发现且具有预后意义。目前，外周血中的CTCs提供了一种易于获得的恶性细胞群，是一种实时的“液体活检”标记物⑺％
我们前瞻性收集了41例乳腺癌患者外周血，利用密度梯度离心进行CTCs富集，甲苯胺蓝染色进行形态学分析以及利用上皮细胞标记物Epcam和CK免疫细胞化学方法鉴定CTCs。当前常用的CTCs检测方法存在局限性,CTCs检测方法包括细胞富集及肿瘤细胞鉴定2个部分。CTCs 富集是CTCs检测的难点，也是CTCs计数及分子特征检测的技术关键叫利用CTCs密度、体积大小、细胞刚性和电性能等物理性质与血细胞不同，可实现对CTCs初步筛选，其中最常用的是密度梯度离心法。物理富集方法的优点是操作简便、价格相对低、对CTCs活性影响小和便于进行下游分析。CTCs的鉴定在蛋白质分子水平利用CTCs 表面的特有分子以区分肿瘤细胞和血细胞，通常基于抗原抗体反应的原理。最常用的特异性标记物有EpCAM和CK等。
我们进一步探讨了CTCs阳性率与临床病理特征及预后的关系，结果表明乳腺癌患者外周血CTC阳性率在乳腺癌分子分型、原发肿瘤分期（T）及TNM分期方面具有显著性差异（P<0.05）o 而与患者年龄、雌激素受体（ER）、孕激素受体（PR）、Ki67、Her-2表达、淋巴结分期（N）、远处转移（M）无显著相关性，差异无统计学意义（均P> 0.05）o部分研究利用Cell Search系统检测乳腺癌外
周血CTCs，结果表明CTCs与患者年龄、激素受体状态、Ki67表达水平、病理类型、组织学分级以及原发肿瘤T分期无明显相关性叫叫本研究结果部分与其相一致。此夕卜，研究表明〔"HER-2阳性患者外周血CTCs阳性率显著高于HER-2阴性患者。HER-2状态是唯一能够可靠预测外周血CTCs存在的原发肿瘤特征。与其相一致，本研究结果表明,HER-2阳性组CTCs阳性率为85.7%, HER-2阴性组CTCs阳性率为64.7%,HER-2阳性组具有更高的阳性率。既往研究1121利用RT_ PCR检测CTCs，结果表明CTCs与淋巴结转移、TNM分期相关。亦有研究"3|利用实时荧光定量PCR法检测外周血CTCs，结果表明在肿块直径〉
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5cm、M10枚腋窝淋巴结转移、TNM分期为ID期、HER-2阳性亚组中，可手术乳腺癌组外周血CTCs阳性率更高。德国的一项针对3173例乳腺癌患者的回顾性分析网结果显示，CTC阳性患者比CTC阴性患者的肿瘤更大，差异具有统计学意义。与此结果相一致，我们的研究结果表明T3+T4亚组、TNM分期为D1+IV期亚组CTCs阳性率更高，差异具有统计学意义。N3亚组呈现更高的CTCs阳性率(100%,6/6)。
平均随访6年余,CTC阳性组与CTC阴性组在远处转移及死亡发生率方面差异无统计学意义。但是CTC
阳性组在随访期间发生远处转移及死亡例数明显多于CTC阴性组。2018年美国癌症联合委员会指南已将CTCs列为乳腺癌预后评估工具，即乳腺癌患者外周血中存在CTCs提示预后不良。本研究样本量有限，尚需扩大样本量进一步论证该结论。
本研究不足之处是，未充分考虑到CTCs中上皮-间充质转化(epithelial-menchymal transition,EMT)的存在。EMT是指上皮细胞通过特定程序转化为具有间充质表型细胞的生物学过程，它能导致E-cadherin、EpCAM等上皮标志物丢失，N-cadherin过度表达以及细胞骨架改变(如波形蛋白表达)，最终产生表型和结构改变，从而导致细胞运动性和侵袭性增强4呵。因此可能低估了CTCs在某些病例中的阳性率，从而对统计学差异产生影响。我们将在后续研究中进一步完善。
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乳腺癌患者循环肿瘤细胞阳性率与预后的关系
（正文见第24页）
B■C》
A
甲苯胺蓝染色（400
*）Pan-cytokeratin(400
*)
*)Ep-CAM(400
图1乳腺癌患幹外周血（：TC的鉴定
慢性苔聲样糠疹伴隐性梅毒误诊为n期梅毒1例
（正文见第53页）蜗牛手工
图1苔薛样糠疹患者胸腹部皮损前胸皮肤散在指甲盖大小的淡红色斑疹，表面轻微糠状细薄鳞屑.图2苔蘇样糠疹患者皮损组织病理病变主要位于表皮和真皮浅层（HEx100）图3苔薛样糠疹患者皮损组织病理角质层呈网篮状，表皮灶性海绵水肿.少量淋巴细胞移入，灶性基底细胞液化变性.真皮浅层血管周围淋巴细胞为主的浸润.可见少数噬黑素细胞（HEx200）
