・论著・PKM2在克罗恩病组织中的表达及意义
张磊杨琳王宏彬周怡
【摘要】目的检测M2型丙酮酸激酶(PKM2)蛋白在克罗恩病(CD)组织中的表
达水平，探究其与患者疾病严重程度及预后的关系。方法前瞻性选取2015年3月至
2017年8月在上海市浦东新区浦南医院就诊的126例CD患者作为研究对象，设为CD
组；另选取同期在该院接受结直肠镜检查并切除肠息肉组织的52例患者作为对照组。
采用蛋白质印迹法检测CD组织和息肉组织中PKM2蛋白表达水平，分析PKM2蛋白表
达水平与CD患者疾病严重程度和预后的关系。结果与对照组相比较，CD组PKM2
蛋白表达水平较低，差异有统计学意义(P<0.05)。CD组患者PKM2蛋白表达水平与
CD简化内镜评分(SES-CD)呈负相关(P<0.05)。预后不良的CD患者PKM2蛋白表达
水平低于预后良好者，差异有统计学意义(P<0.05)。多因素Logistic回归分析结果显
示，疾病行为、肛周病变和PKM2蛋白表达水平与CD患者的预后关系密切(P<0.05)。
结论CD患者PKM2蛋白表达水平越低提示其病情越严重。检测CD组织中PKM2蛋
白表达水平有助于评估CD患者疾病严重程度及预后情况。
【关键词】克罗恩病；M2型丙酮酸激酶；预后
DOI：103969/jissn1673-534X202102009
Expression and significance of PKM2in the tissue of Crohn，s dia ZHANG Lei,WANG Hongbin,
没有放弃ZHOU Yi.Department of Gastroenterology,Punan Hospital,Shanghai Pudong New Area,
Shanghai200125,China;YANG Lin.Department o f Pediatrics,Punan Hospital,Shanghai Pudong
New Area,Shanghai200125,China
【Abstract】Objective This paper aims to investigate the expression of M2pyruvate kina
(PKM2)in the tissue of Crohn's dia(CD)and its relationship with verity and prognosis.Methods
One hundred and twenty six patients with CD(CD group)who were treated from March2015to
August2019in Punan Hospital,Shanglai Pudong New Area were lected prospectively as the subjects.
A totll of52patients who underwent colorectal examination and rection of intestinal polyps during the
same period in the same hospital were lected as the control group.Western blot was ud to detect the
expression of PKM2protein in CD and polyp tissues.The relationship between the expression of PKM2
protein and the verity and prognosis of the CD patients was analyzed.Results The expression of
PKM2protein in the CD group was lower than that in the control group,and the difference was
statistically significant(P V0.05).There was a negative correlation between the expression of PKM2
protein and CD simplified endoscopic score(SES-CD)in patients in the CD group(P V0.05).The expressionofPKM2proteininpatientswithpoorprognosiswaslowerthanthatinpatientswithgood
prognosis,and the difference was statistically significant(P V0.05).The logistic multivariate regression analysisshowedthatdiabehavior，perianallesions，andtheexpressionofPKM2proteinwerecloly
related to the prognosis of patients with CD(P V0.05).Conclusions The lower the expression of
PKM2protein in CD patients is，the moreriousthediais．Thedetectionoftheexpressionof
PKM2protein in the tissue of CD is helpful for evaluating the dia and prognosis of CD patients.
作者单位：200125上海市浦东新区浦南医院消化内科（张磊、王宏彬、周怡），儿科（杨琳）
通信作者：周怡，Email:zhouyi_
【Key words】Crohn's dia；M2pyruvate kina；Prognosis
克罗恩病（CD）是一种炎症性肠病，目前病因尚未完全阐明］1］。CD的病变特点为肠道炎性反应迁延不愈，且多累及回肠末端，严重时可并发肠狭窄、梗阻、穿孔或肛周病变［勺。尽早评估CD患者疾
病严重程度及预后对后续治疗具有重要意义。白细胞计数、C反应蛋白等炎性反应指标可评估CD疾病严重程度，但敏感度或特异度较低4。因此，亟需探究能够准确评估CD患者疾病严重程度及预后的生物标志物。肠黏膜在阻止胃肠道病菌侵入机体及维持全身免疫系统方面发挥着重要作用。CD发病时可使肠黏膜受损而发生炎性反应，致使肠上皮细胞凋亡。研究表明,M2型丙酮酸激酶（PKM2）的上调可通过调控B细胞淋巴瘤-XL（Bcl-XL）蛋白表达保护肠上皮细胞，使其免于凋亡5。本文检测了CD组织中PKM2蛋白的表达水平，并探究其评估CD患者疾病严重程度和预后的价值。
1资料与方法
1.1一般资料
前瞻性选取2015年3月至2017年8月在上海市浦东新区浦南医院就诊的126例CD患者作为研究对象，设为CD组。根据《中国炎症性肠病组织病理诊断共识意见》6中关于CD诊断的相关内容进行诊断。纳入标准：（1）年龄18〜60岁；（2）接受结直肠镜检查；（3）签署了知情同意书。排除标准：（1）合并除CD以外的自身免疫性疾病；（2）入组前服用过抗炎药物；（3）合并严重心、肝、肾等脏器功能异常;（4）合并急性感染性肠炎；（5）合并恶性肿瘤；（6）不能配合随访。另选取同期在本院接受结直肠镜检查并切除肠息肉组织的52例患者作为对照组。CD组中男性81例，女性45例，年龄28〜54岁，平均年龄为（40.25士5.45）岁；对照组中男性33例，女性19例，年龄29〜50岁，平均年
盘古开天龄为（3&64士4.28）岁。两组的性别（才=0.011,F= 0.917）、年龄（=0.720,P=0.472）相比较，差异无统计学意义（P〉0.05），具有可比性。本研究经医院医学伦理委员会批准。
1.2方法
1.2.1信息收集收集受试者的年龄、性别、吸烟史、病变位置、上消化道受累、C反应蛋白、红细胞沉降率、疾病行为和肛周病变等临床信息。C反应蛋白〉8mg/L定义为升高，红细胞沉降率〉15mm/h 定义为升高。1.2.2PKM2蛋白表达水平检测采用蛋白质印迹法检测CD组织及息肉组织中PKM2蛋白表达水平7。于结直肠镜检查时留取受试者CD组织和息肉组织的病理标本，将RIPA裂解液分别滴加至盛有CD及息肉组织的容器中，提取总蛋白，采用BCA法进行定量。然后，滴加匀浆缓冲液在4C的离心机中以3500r/min离心15min，取上清液。电泳100min至漠酚蓝跑出胶面，缓冲液漂洗，浸入转膜缓冲液中转膜。PBS洗膜，加入兔抗人PKM2抗体（购自武汉益普生物科技有限公司），4C孵育过夜。PBST漂洗，加入山羊抗兔二抗（购自武汉益普生物科技有限公司），室温孵育1h。曝光显影，采用ImageJ软件进行光密度分析。
元曲四大家及其代表作1.2.3CD疾病严重程度评估采用CD简化内镜评分（SES-CD）评估CD患者的疾病严重程度SES-CD评分将肠道分为末端回肠、右半结肠、横结肠、左半结肠和直肠5个部分，参考以下4个维度：溃疡大小、溃疡面积、受累肠道面积及肠腔狭窄情况，各维度评分均为0〜3分，分数越高表示越严重。SES-
CD评分为各维度评分之和,0-3分为缓解, 4〜10分为轻度活动，11〜19分为中度活动，20分及以上为重度活动。
1.2.4预后评估采用电话随访方式了解CD患者的预后情况。CD患者出院3个月后开始随访，了解其2年内的并发症、手术及CD相关死亡情况，随访终点为患者死亡或末次随访时间（2019年8月20日）。将发生肠痿、复杂肛痿、肠穿孔、消化道大出血、腹腔脓肿、肠梗阻等并发症，接受肠切除手术治疗，以及CD相关死亡判定为预后不良9。
1.3统计学方法
采用SPSS26.0软件进行统计学分析。正态分布的计量资料以均数士标准差&士s）表示，两组间比较采用独立样本L检验，多组间比较采用单因素方差分析。计数资料以例（％）表示，组间比较采用才检验。采用Pearson相关性分析法探究CD组患者PKM2蛋白表达水平与SES-CD评分的关系。采用多因素Logistic回归模型分析影响CD患者预后的相关因素。P V0.05为差异有统计学意义。
2结果
2.1PKM2在CD组织中的表达
CD组PKM2蛋白的相对表达量为0.47±0.11，低于对照组（1.08±0.14），两组差异有统计
学意义（二 31.250, P <0. 001）。
2.2 PKM 2与CD 疾病严重程度的关系
CD 组患者平均SES-CD 评分为（8. 85±2. 41）
分。Pearson 相关性分析结果显示，CD 组患者 PKM 2蛋白表达水平与SES-CD 评分呈负相关关系 （厂二-0.891,P V 0.001）。见图 1
图1 PKM 2与SE&CD 评分关系的散点图
2. 3 PKM 2在不同预后的CD 患者中的表达
随访发现,26例CD 患者中有40例（31.75%）
预后不良，包括5例（3.97%）肠痿，例（4.76%）复
杂肛痿，例（2.38%）肠梗阻，例（3. 17%）腹腔脓 肿，例（2.38%）消化道大出血,9例（15.08%）接
受肠切除手术治疗。预后不良的CD 患者PKM 2 蛋白相对表达量为0. 34±0. 05，低于预后良好的
CD 患者（0. 53 ± 0. 08）两组差异有统计学意义（（二
16. 432,P <0.001）。
24 PKM 2 与 CD 患者预后的关系
预后不良患者和预后良好患者在年龄、性别、
吸烟史、病变位置、上消化道受累、C 反应蛋白和红
国际睡眠日细胞沉降率方面比较，差异均无统计学意义（P 均〉
0. 05）；在疾病行为和肛周病变方面比较，差异均有
统计学意义（P 均<0.05）。见表1。
将可能与CD 患者预后有关的因素，包括上消
化道受累（非上消化道受累二0，上消化道受累二
1）、疾病行为（非狭窄非穿透型二0，狭窄型=1，穿
透型二2）、肛周病变（非肛周病变二0，肛周病变二
1）和PKM 2蛋白表达水平（原始值录入）作为自变
量，纳入标准«C 0 1，将CD 患者的预后情况作为因
变量，纳入多因素Logistic 回归模型分析，结果显示 疾病行为、肛周病变和 PKM 2 蛋白表达水平与 CD 患者预后关系密切（P V 0.05）。见表2。
表1影响CD 患者预后的单因素分析
预后不良（n = 40）
预后良好（n =86）
统计值
P 值
项目
年龄/岁39. 47 士 4. 2640. 61±4. 13
l = 1. 428
0156性别/例（％）X = 0. 264
0608
男27(67. 50)
54(62. 79)女
13(32. 50)32(37. 21)
吸烟史/例（％）X = 0. 280
0597
是6(15. 00)10(11.63)否
34(85. 00)
76(88.3 7)
病变位置/例（％）X = 4. 008
0135
回肠末端9(22. 50)
10(11.63)
结肠4(10. 00)18(20. 93)回结肠
27(67. 50)58(67. 44)
上消化道受累/例（％）X = 3. 803
0051
是12(30. 00)13(15. 12)否
28(70. 00)73(84. 88)
疾病行为/例（％）X = 7. 015
0030
非狭窄非穿透型27(67. 50)75(87. 21)狭窄型8(20. 00)6(6. 98)穿透型
偷钱
5(12. 50)5(5. 81)
C 反应蛋白/例（％）X = 0. 268
0605
升高33(82. 50)
74(86. 05)正常
7(17. 50)
12(13. 95)
红细胞沉降率/例（％）X = 0. 020
0888
升高26(65. 00)
57(66. 28)正常
14(35. 00)29(33. 72)
肛周病变/例（％）X = 5. 905
0015
清蒸咸鱼干
是13(32. 50)12(13. 95)否
27(67. 50)
怀孕能剪头发吗74(86. 05
)
表2影响CD患者预后的多因素Logistic回归分析
项目0值标准误Wald值犘值OR值95%犆犐
上消化道受累0.91105982245014612050.714〜2.287疾病行为 1.9020.68865740008 4.352 1.976〜7.243肛周病变 1.8400.67172200002 2.4131395〜5777 PKM219040.7266911000644872004〜9200
3讨论
CD发病过程中，白细胞计数、C反应蛋白、血小板计数、红细胞沉降率、血红蛋白和白蛋白水平等炎性反应指标将发生变化，但上述指标在判断CD 疾病严重程度方面存在不足，敏感度或特异度较低，
临床价值有限如。结直肠镜检查是评估CD 疾病严重程度的金标准，但患者接受度较低，操作较为繁琐，且难以多次进行。因此，探寻敏感度和特异度均较高且操作便捷的指标尤为重要。
PKM2是一种糖酵解关键代谢酶，在机体内以二聚体或四聚体形式存在］卯。二聚体的活性较低，主要存在于肿瘤细胞中；而四聚体的活性较高，主要存在于正常的、处于增殖状态的细胞中］18］。研究表明，PKM2可催化磷酸烯醇式丙酮酸转化为乳酸，同时生成三磷酸腺苷，维持细胞增殖和代谢［921。此外,PKM2还可以调控Wnt/-catenin 信号通路及Bcl-XL蛋白表达，从而抑制细胞凋亡522］。
本研究结果显示,CD组PKM2蛋白的表达水平低于对照组，提示PKM2可能与CD的发病有关。SES-CD评分可反映CD患者的疾病严重程度。本研究发现,PKM2蛋白表达水平与SES-CD评分呈负相关关系，提示PKM2可能参与了CD的疾病进展过程。基于上述结果，本文比较了不同预后的CD患者PKM2蛋白表达水平，结果显示预后不良CD患者的PKM2蛋白表达水平低于预后良好者，提示PKM2与CD患者的预后密切相关。多因素Logistic回归分析结果显示，疾病行为、肛周病变情况和PKM2蛋白表达水平与患者的预后关系密切。
综上所述,CD患者PKM2蛋白表达水平越低提示其病情越严重。狭窄型或穿透型CD、合并肛周病变及低PKM2蛋白表达水平的CD患者发生预后不良的风险较高。检测CD组织中PKM2蛋白表达水平有助于评估CD患者的疾病严重程度和预后。本研究存在一定的不足之处，如入组患者的病程长短不一，可能
使结果存在一定偏倚；未在治疗过程中检测CD组织中PKM2蛋白的表达水平，了解其动态变化及对疗效的评估价值。今后将针对以上不足开展多中心研究和基础研究，以阐明PKM2在CD发病及进展中的作用。
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(收稿日期：2020-03-13)
(本文编辑：周骏)
更正说明
刊登于本刊2020年第40卷第6期404〜408页《液体活组织检查在胰腺癌早期诊断中应用的研究进展》一文，作者的单位原文章中为“武汉大学第一临床学院武汉大学人民医院胰腺外科”，现更正为“武汉大学人民医院胰腺外科”。
