作物学报ACTA AGRONOMICA SINICA 2016, 42(9): 1332 1341/
ISSN 0496-3490; CODEN TSHPA9E-mail: DOI: 10.3724/SP.J.1006.2016.01332一年级数学课本
甘蔗捕光叶绿素a/b结合蛋白基因ScLhca3的克隆及表达
翟玉山邓宇晴董萌徐倩程光远彭磊林彦铨*徐景升*
福建农林大学 / 农业部福建甘蔗生物学与遗传改良重点实验室, 福建福州 350002
摘要: 捕光叶绿素a/b结合蛋白是植物光系统I (photosystem I, PSI)中与色素分子结合的膜蛋白, 由Lhca基因家族
编码, 主要参与光合作用中光能的捕获与传递。本研究对甘蔗叶片cDNA文库测序, 获得甘蔗PSI中Lhca3基因的cDNA序列, 命名为ScLhca3 (GenBank登录号为KU215669)。生物信息学分析表明, ScLhca3的开放读码框(opening reading frame, ORF)长度为804 bp, 编码267个氨基酸, 分子量为28.91 kD, 等电点为8.96; ScLhca3被定位于叶绿体,
无信号肽, 存在3个明显的跨膜区域, 含有典型的捕光叶绿素a/b结合蛋白功能域(chlorophyll a/b binding domain), 为
亲水性非分泌蛋白。多序列比对和进化分析表明, ScLhca3在不同物种间具有较强的保守性, 具有种属特性。构建原
核表达载体pGEX-6P-1-ScLhca3, 通过IPTG诱导表明, ScLhca3蛋白与预测大小一致。亚细胞定位试验显示, ScLhca3
与报告基因GFP的融合蛋白定位于叶绿体中。实时定量PCR分析表明, ScLhca3在成熟叶片中的相对表达量最高, 根
中几乎不表达, 具有明显的组织特异性; 在CdCl2、ABA和H2O2外源胁迫下, ScLhca3均上调表达; 在黑暗、NaCl
和PEG胁迫下则下调表达。
关键词：甘蔗; 光系统I; 捕光叶绿素a/b结合蛋白; 实时定量PCR
Cloning and Characterization of Light Harvesting Chlorophyll a/b-Binding Protein Coding Gene (ScLhca3) in Sugarcane
ZHAI Yu-Shan, DENG Yu-Qing, DONG Meng, XU Qian, CHENG Guang-Yuan, PENG Lei, LIN Yan-Quan*, and XU Jing-Sheng*个人热点怎么开
Fujian Agriculture and Forestry University / Key Laboratory of Sugarcane Biology and Genetic Breeding, Ministry of Agriculture, Fuzhou 350002, China
Abstract: The Lhca gene family in green plants encodes veral light-harvesting chlorophyll a/b-binding proteins that harvest and transfer light energy to the reaction center of photosystem I (PSI) in photosynthesis. The cDNA quence of Lhca3 gene was firstly obtained from sugarcane leaf full-length cDNA library through quencing and validated by homology comparison. It was designated ScLhca3 and submitted to the GenBank (accession number: KU215669). ScLhca3 contains an 804 bp open reading frame (ORF) and encodes a deduced protein of 267 amino acids, with a molecular weight and pI of 28.91 kD and 8.96, respectively. Bioinformatics analysis showed that ScLhca3 is a hydrophilic non-cretory protein with three transmembrane domains and a chlorophyll a/b binding domain. Sequence multi-alignment and phylogenetic analysis demonstrated that the ScLhca3 protein quence shared a high identity with Lhca3 from other plants, with the specificity of species. The protokaryotic expression vector pGEX-6P-1-ScLhca3 was constructed and expresd in E. coli cells under the induction of IPTG. The subcellular localization experiment showed that the ScLhca3 fud with GFP, a reporter protein, was located on chloroplast. Real-time quantitative PCR analysis showed the expression of ScLhca3 had a clear tissue specificity, and was upregulated by CdCl2, ABA, and H2O2, but downregulated by darkness, NaCl, and PEG.
Keywords: Sugarcane; Photosystem I; Light harvesting chlorophyll a/b-binding protein; Real-time quantitative PCR
本研究由国家高技术研究发展计划(863计划)项目(2013AA102604), 国家自然科学基金项目(31171605, 31371688)和国家现代农业产业技术体系建设专项(CARS-20-1-1)资助。
This study was supported by the National High-tech Rearch and Development Program of China (2013AA102604), the National Natural Science Foundation of China (31171605, 31371688), and the China Agriculture Rearch System (CARS-20-1-1).
*通讯作者(Corresponding authors): 林彦铨, E-mail: ; 徐景升, E-mail: , Tel: 139********
第一作者联系方式: E-mail: , Tel: 184********
Received(收稿日期): 2016-01-11; Accepted(接受日期): 2016-05-09; Published online(网络出版日期): 2016-05-30.
URL: /kcms/detail/11.1809.S.20160530.0905.002.html
第9期翟玉山等: 甘蔗捕光叶绿素a/b结合蛋白基因ScLhca3的克隆及表达1333
捕光叶绿素a/b结合蛋白(light harvesting chlo-rophyll a/b binding protein, LHC)是光合系统中的重要功能蛋白, 定位于叶绿体类囊体膜上, 与色素结合形成捕光色素蛋白复合体[1]。该复合体能捕获光能, 并迅速把光能传到PSI (photosystem I, PSI)和光系统II (photosystem II, PSII)的反应中心, 引起光化学反应, 将光能转化为化学能。在高等植物和绿藻中, PSI复合物由PSI核心复合物(PSI-CC)和捕光色素蛋白复合体I (LHCI)两部分组成[2]。真核生物的PSI复合物包括了一系列捕光叶绿素a/b结合蛋白即LHCI, 它们结合大约100个叶绿素分子以增大捕光截面, 并且因为含有叶绿素b和类胡萝卜素而可以捕获光谱中不同波长的光[2-3]。通常LHCI含有Lhca1、Lhca2、Lhca3和Lhca4捕光蛋白, 由核基因编码, 分子量在20~29 kD之间, 在细胞质中合成后在引导肽的作用下被运输进叶绿体并整合到类囊体膜上[2,4]。根据荧光发射波长的不同, LHCI又分为LHCI-730和LHCI-680两部分, 其中LHCI-730是由Lhca1和Lhca4形成的异源二聚体; LHCI-680由Lhca2和Lhca3形成的同源二聚体[5]。近年来在拟南芥、水稻和杨树中, 又发现了Lhca基因的2个新类型Lhca5和Lhca6, 但因表达量非常低, 导致其在以往的研究中被忽略[6-8]。
与PSII相比, PSI在植物上的研究较少, 主要是以菠菜、豌豆和大麦等植物为试验材料, 研究其蛋白组成、基因结构和结构生物学[9-10]。高荣孚等[11]研究油松上的PSI发现存在2种PSI。有报道称, PSI 相对于PSII对逆境胁迫抵抗性强, 是某些环境胁迫的最初作用部位[12]。作为PSI中最重要的功能蛋白之一, LHCI蛋白目前的研究主要集中在光能的捕获与传递方面[13], 涉及物种较少, 而且基因结构、编码蛋白的生化特性、进化关系及胁迫应答等方面的研究报道尚少。
甘蔗(Saccharum officinarum L.)是我国和全世界主要的糖料作物和能源作物[14], 同时, 甘蔗的光饱和点高, 属高光效C4作物。高产、高糖和抗逆等农艺性状形成的分子机制一直是甘蔗基础研究中的热点。本研究从甘蔗叶片cDNA文库[15]中获得了甘蔗PSI的Lhca3编码序列, 运用生物信息学方法预测该基因的结构和功能, 明确了该基因编码蛋白的亚细胞定位, 并利用实时荧光定量PCR技术研究了该基因在不同组织中以及不同逆境胁迫下的表达模式, 为进一步研究Lhca家族基因在甘蔗PSI中的功能提供了试验依据。1 材料与方法
1.1 材料及处理方法
甘蔗叶片cDNA文库、供试甘蔗品种热带种Badila和健康本氏烟苗株, 均由福建农林大学农业部福建甘蔗生物学与遗传育种重点实验室提供[15]。
使用Badila组培苗研究目的基因受不同外源胁迫后的表达特性。参照侯朝祥等[16]方法, 采用腋芽快繁技术培养Badila组培苗。待苗株高15~25 cm、出现4~5片完全展开叶时, 转移到清水中培养, 28℃下光照16 h/黑暗8 h, 复性培养1周。选取长势一致的幼苗, 进行黑暗(1、3、6和12 d)、重金属镉(50 μmol L–1 CdCl2, 12、24和48 h)、过氧化氢(10 mmol L–1 H2O2, 3、12和24 h)、ABA (100 μmol L–1 ABA, 3、12和24 h)、高盐(250 mmol L–1 NaCl, 6、12和24 h)和模拟干旱(25% PEG-8000, 6、12和24 h)胁迫处理, 每个处理3个重复, 每个重复3株, 以正常生长条件下的甘蔗幼苗作为对照。另外, 在田间随机选取9株处于分蘖期且长势一致健康的Badila植株, 分成
瑶台曲3组, 每组3株。取其白色嫩根、心叶(未展开的叶)、+1叶(甘蔗最高可见肥厚带的第一叶)、侧芽、叶鞘和蔗茎, 用于研究目的基因的空间表达特性。取样后立即将样品用液氮速冻, 置–80℃冰箱保存备用。1.2 总RNA提取和cDNA合成
采用TRIzol试剂提取样品总RNA, 取1.0 μL RNA, 以1.0%琼脂糖凝胶电泳检测RNA质量。使用Nanodrop (Thermo Scientific, USA)测定RNA的浓度, 按照Prime Script RT Reagent Kit使用说明书, 将RNA反转录成cDNA。
1.3 甘蔗ScLhca3基因序列的获得和生物信息学分析
对甘蔗叶片cDNA文库进行大规模测序和生物信息学分析[15]。挑取含有目的基因的克隆测序, 获得目的基因的序列。利用NCBI的ORF finder软件, 分析所获cDNA序列的开放阅读框及其推测氨基酸序列, 利用ProtParam (/tools/prot param.html)预测一级结构, 利用SignalP 4.1 Server (www.cbs.dtu.dk/rvices/SignalP/)进行信号肽分析, 利用TMHMM Server v. 2.0 (www.cbs. dtu.dk/rvices/TMHMM/)进行跨膜结构域分析, 利用Cell-PLoc (www.csbio./bioinf/Cell- PLoc/)进行亚细胞定位分析, 利用Motif Scan (/)和Inter Proscan (www. ebi.ac.uk/interpro/scan.html)进行功能结构域分析,
1334作物学报第42卷
利用DNAMAN进行多序列比对, 利用ClustalX和MEGA5.1构建系统进化树。
1.4 ScLhca3蛋白的原核表达
根据测序获得ScLhca3的开放读码框(ORF), 设计带有合适酶切位点的特异性引物(表1), 以ScLhca3质粒为模板, 扩增并回收目的基因片段。回收产物经Bam H I和Eco R I酶切后, 用T4 DNA连接酶连接到同样双酶切的原核表达载体pGEX-6P-1, 然后转化至大肠杆菌DH5α感受态细胞, 进行阳性克隆子筛选, 提取阳性克隆质粒用Bam H I和Eco R I 双酶切鉴定, 将阳性克隆送上海生物工程有限公司测序, 测序结果正确的阳性克隆即为重组质粒, 命名为pGEX-6P-1-ScLhca3。将空质粒pGEX-6P-1和重组质粒pGEX-6P-1-ScLhca3转化入大肠杆菌Rotta (DE3)中, 挑取单菌落, 接种至含有氨苄青霉素(50 mg L–1 Amp+)的LB液体培养基中, 37℃培养过夜。取1 mL培养物接种至20 mL LB液体培养基(含50 mg L–1 Amp+)中培养至OD600为0.6时, 加入终浓度为1 mmol L–1的IPTG, 37℃诱导12 h, 每2 h取样1 mL。分别取样品300 μL, 4 8000 ×
℃g离心10 min后收集菌体, 加入30 µL蛋白上样缓冲液, 沸水浴5 min, 常温下12 000 × g离心5 min, 取10 µL上清液经12% SDS-PAGE电泳检测融合蛋白的表达。1.5 ScLhca3蛋白的亚细胞定位
以ScLhca3-GFP-F和ScLhca3-GFP-R为引物(表1), ScLhca3质粒为模板, 扩增ScLhca3完整的ORF。PCR产物经Xba I与Bam H I双酶切后, 连入同样双酶切处理的亚细胞定位载体pCAMBIA1302, 转化大肠杆菌DH5α感受态细胞, 经PCR、双酶切和测序鉴定后, 得到植物表达载体pCAMBIA1302- ScLhca3。按照Green等[17]的方法将植物表达载体转入农杆菌EHA105, 通过菌落 PCR鉴定重组农杆菌。然后取健康的本氏烟叶片, 参照Sparkes等[18]农杆菌侵染方法, 将重组农杆菌注射入健康的本氏烟叶片, 48 h后在激光共聚焦显微镜(Leica TCS SP5 II)下观察本氏烟叶片表皮细胞中ScLhca3蛋白的定位结果。
1.6 甘蔗ScLhca3基因的实时荧光定量PCR表达分析
根据ScLhca3基因的ORF序列, 设计特异性实时荧光定量PCR引物, 以Badila各组织及各胁迫后的叶片cDNA为模板, 以GAPDH基因(表1)为内参基因[19], 按照SYBR Green PCR Master Mix Kit (Roche)说明书配置定量反应体系。实时荧光定量PCR扩增程序为: 50 2 min; 95 10 min; 95 15
℃℃℃
电流元
s、60 1 min,
℃循环40次。每个样品设置3次重复, 以无菌水作对照, 采用2–ΔΔCt算法进行基因表达水平分析[20]。
2结果与分析
2.1 ScLhca3基因的获得与生物信息学分析
在对甘蔗叶片cDNA文库大规模测序的过程中, 发现了1个与玉米基因(XM_008660371.1)同源性高达96%的基因片段, 序列分析显示, 该基因片段长1009 bp, 包含一个804 bp的ORF, 编码267个氨基酸(图1), 被命名为ScLhca3 (GenBank登录号为KU215669)。
ProtParam分析表明, ScLhca3基因编码的蛋白的分子量为28.91 kD, 等电点为8.96, 不稳定系数为36.56, 脂溶指数为83.75, 总平均疏水性是–0.068, 表明该蛋白可能是一种亲水蛋白。利用SignalP 4.1 Server在线软件对ScLhca3蛋白的信号肽预测表明,
表1实验中用到的扩增引物Table 1 Primers ud in this study
引物名称Primer name
引物序列
Primer quence (5′→3′)
目的
Strategy
ScLhca3-GFP-F TGCTCTAGAATGGCAGCTCAGGCTCTCC 亚细胞定位Subcellular localization ScLhca3-GFP-R CGCGGATCCGTGGAACTTGAGGCTGGTG 亚细胞定位Subcellular localization ScLhca3-6P-F CGCGGATCCATGGCAGCTCAGGCTCTCC 原核表达 Prokaryotic expression ScLhca3-6P-R CCGGAATTCGTGGAACTTGAGGCTGGTG 原核表达 Prokaryotic expression ScLhca3-QF CGACTCCTACACGCTCTT 荧光定量 Real-time PCR ScLhca3-QR TCTCCTTCTCGGTCTTGC 荧光定量 Real-time PCR GAPDH-QF CACGGCCACTGGAAGCA 荧光定量 Real-time PCR GAPDH-QR TCCTCAGGGTTCCTGATGCC 荧光定量 Real-time PCR
下画线部分表示酶切位点。Sequences underlined indicate enzyme restriction site.
第9期
翟玉山等: 甘蔗捕光叶绿素a /b 结合蛋白基因ScLhca3的克隆及表达 1335
图1 获得的ScLhca3基因的cDNA 全长序列及其氨基酸序列
Fig. 1 cDNA quence and amino acid quence of ScLhca3 gene obtained
*终止密码子。*stop codon.
该蛋白不含信号肽, 是非分泌蛋白。根据TMHMM Server v. 2.0在线分析, ScLhca3蛋白具有3个明显的跨膜区域, 分布在第95~121、第137~160、第220~ 249位区域, 膜向性分别为i →o 、o →i 、i →o 。用Cell-PLoc 进行亚细胞定位分析表明, ScLhca3蛋白定位于叶绿体。使用 Inter Proscan 和Motif Scan 在线分析软件对 ScLhca3蛋白进行分析, 显示第55~238位包括一个典型的捕光叶绿素a/b 结合蛋白功能域(chlorophyll a/b binding domain); 第8~10、第25~27、第208~210和第263~265位为蛋白激酶C 的磷酸化位点(protein kina C phosphorylation site); 第58~61、第76~79和第208~211位为酪蛋白激酶II 磷酸化位点(Cain kina II phosphorylation site); 第62~67、第104~109和第237~242位为N-肉豆蔻酰位点(N-myristoylation site)。
2.2 ScLhca3蛋白的氨基酸同源性分析
上升天秤
使用NCBI 网站的Blastp 搜索ScLhca3的同源序列, 选择玉米(Zea mays , XP_008658593.1)、谷子(Setaria italica , XP_004965906.1)、水稻(Oryza sativa , BAD25284.1)、二穗短柄草(Brachypodium d我得到了理解
istachyon , XP_010233979.1)、乌拉尔图小麦(Triticum urartu , EMS56059.1)、拟南芥(Arabidopsis thaliana , NP_ 001185280.1)、大豆(Glycine max , NP_001276264.1)、 葡萄(Vitis vinifera , XP_002273201.1)、盐芥(Eutrema halophilum , BAJ33764.1)、豌豆(Pisum sativum , AAA84545.1)的Lhca3蛋白序列进行氨基酸同源性
分析。结果如图2所示, 甘蔗ScLhca3蛋白与其他物种Lhca3蛋白在N 端保守性较差, C 端有较大的保守性, 且与玉米、谷子、水稻、乌拉尔图小麦和二穗短柄草的蛋白相似度分别为98.5%、98.8%、82.1%、81.4%和81.7%, 表明ScLhca3基因编码的氨基酸序列与单子叶植物的同源性较高。
以莱茵衣藻(Chlamydomonas reinhardtii , XP_ 001701405.1)的Lhca3蛋白序列作为外源序列, 使用ClustalX 和MEGA5.1软件, 采用NJ 法(BootStrap 1000)构建进化树, 分析ScLhca3蛋白与其他物种Lhca3蛋白的进化关系, 结果如图3所示。单子叶植物和双子叶植物的Lhca3蛋白明显属于两大不同的分支, 且在单子叶植物分支中, 甘蔗与同属C 4植物的玉米和谷子为同一分支, 而同属C 3植物的水稻、小麦和二穗短柄草为另一分支。这表明, 该基因在遗传进化上具有明显的种属差异性, 它们对应的蛋白属于同一个家族。
2.3 ScLhca3蛋白的原核表达分析
将重组质粒测序, 并用Bam H I 和Eco R I 双酶切电泳检测。从图4泳道2中可以看出, 重组质粒经过双
酶切之后电泳结果出现5000 bp 左右的载体片段和800 bp 左右的目的基因, 结合测序结果证明, ScLhca3和表达载体pGEX-6P-1重组成功。图5中重组质粒SDS-PAGE 电泳结果显示, 在分子量54 kD 左右处可见一条特异性条带, 且随诱导时间的延长, 蛋白浓度逐渐增加。ScLhca3蛋白约为28.91 kD,
1336
作 物 学 报 第42卷
图2 甘蔗ScLhca3蛋白与其他植物种蛋白的氨基酸序列比对
Fig. 2 Homology analysis of quences from sugarcane ScLhca3 and tho of other species
加上pGEX-6P-1载体上26 kD 大小的GST 标签蛋白, 因此与预测的蛋白大小基本相符, 可以确定该融合蛋白成功表达。
2.4 ScLhca3蛋白的在本氏烟细胞中的定位
重组荧光定位表达载体pCAMBIA1302-ScLhca3经酶切和测序验证后(图4泳道1), 转化到农杆菌 EHA105中, 通过烟草瞬时表达体系表达了ScLhca3和GFP 的融合蛋白, 于激光共聚焦显微镜下观察融合蛋白绿色荧光在细胞中的分布, 结果如图6所示。对照GFP 在烟草表皮细胞中大量表达, 绿色荧光信号在细胞质、质膜和细胞核中均有分布; 而ScLhca3-GFP 融合蛋白主要定位于叶绿体中, 定位结果与生物信息学分析预测一致。
2.5 ScLhca3基因的组织特异性表达分析
基于实时荧光定量PCR 技术, 以心叶的表达量
ann英文名含义是什么为参照基准, 采用2–ΔΔCt 法对甘蔗各组织ScLhca3基因表达量的分析结果如图7所示。ScLhca3基因
的表达具有明显的组织特异性, 在不同组织中的表达量差异较大, 其中在成熟叶片中相对表达量最高, 侧芽、心叶和叶鞘中次之, 茎中微量表达, 根中几乎不表达。
2.6 ScLhca3基因在不同外源胁迫下的表达特性分析
彩泥手工图片
根据荧光定量PCR 的数据分析ScLhca3基因在不同外源胁迫下的相对表达量, 如图8所示。ScLhca3能够被CdCl 2、H 2O 2和ABA 强烈诱导上调表达。不同的是, 在CdCl 2和H 2O 2胁迫下, ScLhca3的表达量均在12 h 达到最大值, 随后下降, 呈上调和恢复的模式, 但从总体看来均高于对照; 而在ABA 条件下, ScLhca3的表达量则随时间的增加而
