G418抗性的小鼠胚胎干细胞滋养层的制备
技术方法
周 江，杨 晓，孙彦旬，吕雅歆，黄翠芬(军事医学科学院生物工程研究所，北京 100071)
[摘要] 目的：制备G418抗性的小鼠胚胎干细胞滋养层。方法：利用一个neo 基因成功整合到基因组的小鼠品系Smad3ex8+/ ，从其妊娠14d 的雌鼠中获取胚胎，先制备小鼠胚胎成纤维细胞,PCR 鉴定基因型后，挑选一株neo 基因杂合型的小鼠胚胎成纤维细胞，用丝裂霉素C 处理即获得G418抗性的小鼠胚胎干细胞滋养层。结果：利用此方法制备的滋养层能有效地支持小鼠胚胎干细胞的生长，在含G418的筛选培养基中能存活1~2周。[关键词] 胚胎干细胞；滋养层
[中图分类号] Q813.1 [文献标识码]A [文章编号] 1000 5501(2001)01 0059 03
Preparation of a kind of G418resistance fibroblast feeder layers
Z HOU Jiang,Y ANG Xiao ,SU N Yan Xun,L Ya Xin,HU ANG Cui Fen
(Institute of Biotechnology,Academy of Military Medical Sciences,Beijing 100071,China)
[Abstract] Objective:To prepare a kind of G418resistance fibroblast feeder layers.Methods:In order to prepare a stock primary e mbryonic fibroblast (E MFI)cells,the pregnant Smad3ex8+
/
mice containing het
erozygous neo gene were killed 14days after coitus to get the embryo.E MFI cells were tested by PCR to iden tify their gene types.Only one E MFI cell which contained heterozygous neo gene was chon and trea ted with mitomycin C.The mitomycin C treated E MFI feeders were stored at -70 .Results:The EMFI feeder layers could support the growth of embryonic stem cell line TC 1efficiently and could live in G418resistance medium for 1-2weeks.
[Key words] embryonic stem cell;fibroblast feeder layers [收稿日期] 2000-06-26
[基金项目] 国家高技术研究发展计划(102 08 08 02)及自然
科学基金(39970413)资助[作者简介] 周 江(1968-)，男，湖北孝感人，硕士，助理研究
员。
胚胎干细胞(embryonic stem cell,ES)是从着床前胚胎(怀孕3~5d)的内细胞团(inner cell mass,IC M)分离得到的、能在体外培养的一种高度未分化细胞，同时还具有发育的全能性，能广泛参与宿主胚胎各组织器官的生长、发育，形成嵌合体。目前小鼠ES 细胞被广泛应用于基因打靶、嵌合体小鼠的制备、转基因小鼠疾病模型的建立以及体外分化等研究[1,2]。
由于多分化潜能是ES 细胞的主要特征之一，体外培养条件的略微变化就可能导致分化机制的启动，因此，在维持细胞分裂增殖的同时抑制其分化倾向是培养中需解决的关键问题。通常采用鼠胚(14d)的原始胚胎成纤维细胞(primary e mbryonic fi broblast,E MFI)或STO 细胞株作为滋养层细胞(feed er cell)来维持其生长，这两种滋养层在贴壁能力和IC M 增殖上没有显著差异，但鼠胚成纤维细胞在促
进ES 细胞集落的形成和生长方面略优于STO 细胞。另外，几种分化抑制因子，如分化抑制激活物(differentiation inhibitory activitor,DIA)、白血病抑制因子(leukemia inhibitory fac tor,LIF)等在体外具有抑制ES 细胞分化作用，而这些因子在原代成纤维细胞中都有相当高的含量，例如LIF 浓度为500~5000I U/ml 。因此，滋养层在ES 细胞体外培养中起关键作用[3]。
光催化反应器随着基于ES 细胞的基因打靶的应用越来越广泛，要获得基因剔除小鼠，首先要构建一个打靶载体，该载体含有一段与靶基因同源的序列，同时插入
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军事医学科学院院刊 2001年3月第25卷第1期Bull Acad Mil Med Sci,M ar 2001; Vol 25 No 1
一个带启动子的选择标记基因通常是neo基因,neo基因的插入不仅灭活靶基因，而且使研究者能用G418在体外筛选中靶ES细胞。因此，要开展基因打靶的研究，首先需建立G418抗性的ES细胞滋养层细胞系。我们利用一个neo基因成功整合到基因组的小鼠品系Smad3ex8+/ ，制备了能运用于基因打靶研究的滋养层细胞[4,5]。
1 材料与方法
1.1 实验材料
Smad3ex8+/ 小鼠为本室保存，性成熟后交配，第2天检测精栓，第14天处死怀孕雌鼠。E S细胞株Tc 1由美国国立卫生研究院的邓初夏博士惠赠。
1.2 主要试剂
LIF,DMEM高糖培养基,L 谷氨酰胺，非必需氨基酸，青链霉素溶液，巯基乙醇，胎牛血清(ES细胞认证)，丝裂霉素C,DMSO,PBS缓冲液(pH7.2), EDTA 胰酶,G418，明胶等试剂分别购自Gibco B RL, Sigma和HyClone公司。
无限江山
滋养层细胞培养液成分:500ml DME M,6ml L 谷氨酰胺,6ml非必需氨基酸,6ml青链霉素溶液, 4 l巯基乙醇,90ml胎牛血清。用一次性滤器过滤,4 保存。
冻存培养液成分:25%胎牛血清,10%DMSO, 65%DME M。使用前配制。
1.3 胎鼠的获取与处理
断颈处死妊娠14d的雌鼠,75%酒精消毒，无菌打开腹腔、取出有胚胎的子宫。在PBS中解剖，去除卵黄囊、羊膜和胎盘，将胎鼠在新的PBS中洗两次。将胚胎的头和内脏去除，用消毒剪刀将胎鼠剪成小的碎片。胎鼠碎片转移到15ml离心管, 1000r/min离心2min。
1.4 原代小鼠胚胎成纤维细胞的分离和培养
将上述处理的胚胎碎片弃上清，加入5ml 0.25%EDTA 胰酶,37 处理30min，加入含10%胎牛血清的DMEM培养液，反复吹打,1000r/min离心2min。弃上清，加入滋养层细胞培养液并将细胞转移到150mm培养皿中，置于含5%C O2的培养箱中培养2~3d，通常第3天胚胎成纤维细胞长满培养皿，该细胞即是原始小鼠胚胎成纤维细胞。
1.5 PCR鉴定小鼠胚胎成纤维细胞基因型
Smad3 5/3 7引物1:5! CC TC TTCATTGCC ATAT GCCC TG 3!;
Smad3 5/3 7引物2:5! CCC GAAC AGTTGGATT CAC ACG 3!; Smad3 5/Rin I A引物3:5! CC AGAC TGCCTTGG GAAAAGC 3!。
细胞DNA提取参见文献[6]。
1.6 小鼠胚胎成纤维细胞滋养层的制备
小鼠胚胎成纤维细胞用作滋养层细胞之前，必须使其生长停止，使它们既能支持ES细胞的生长又不会长得超过培养的ES细胞。
春江晚景图将一管基因型鉴定为neo基因杂合的细胞在37 水浴中快速解冻，细胞转移到有2ml培养液的离心管中,1000r/min离心2min。弃上清，加入新鲜的滋养层细胞培养液，转移到2个直径100mm的培养皿中，在37 的CO2培养箱中培养。3d后，胰酶处理细胞并转移到6个直径150m m培养皿中, 37 培养3d。再将细胞从6个直径150mm培养皿转移至40个直径150mm培养皿中,37 培养3~4 d。将3管丝裂霉素C(2mg/管)，每管加3.3ml PBS，合并共10ml，添加到600ml培养液中，使丝裂霉素C终浓度10 g/ml，每个培养皿加15ml培养液,37 继续培养2~3h。弃去培养液，用PB S洗一次，每个培养皿加3ml0.25%EDTA 胰酶,37 处理10min，加10ml滋养层细胞培养液终止反应。将细胞收集到50ml离心管,1000r/min离心2min。加入冻存细胞培养液40ml，分成40小管，于-70 冻存，每管解冻后可以铺满4~5个直径100mm培养皿。
1.7 ES细胞的培养
豆浆油条预先用0.1%明胶处理培养皿。解冻ES细胞的前一天先要解冻滋养层细胞，滋养层细胞通常在解冻2~3h后应可贴壁。将E S细胞快速解冻，离心去DMSO，将滋养层细胞培养液换成ES细胞培养液(滋养层细胞培养液+1000U/ml LIF)，将ES细胞转移到有滋养层细胞的培养皿中，于37 、5% CO2培养箱中培养。每天更换新鲜ES细胞培养液。山花烂漫时
2 结果和讨论
2.1 PC R鉴定小鼠胚胎成纤维细胞基因型[5]
引物1和引物2位于Smad3基因上,Smad 3ex8+/+和Smad3e x8+/ 可以扩增出400bp的Smad3基因片段；引物3位于neo基因上,Smad3ex8 / 和Smad3ex8+/ 用引物1和引物3能扩增出250bp条带(图1)。因此,neo基因阴性，只能扩增出400bp; neo基因阳性纯合子，只能扩增出250bp;neo基因阳性杂合子，可同时扩增出400bp和250bp，挑选1株该基因型的小鼠胚胎成纤维细胞，用丝裂霉素C 作进一步处理。
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图1 PC R 鉴定小鼠胚胎成纤维细胞基因型
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< +/+;
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7. D NA/Hin d ∀标志物
2.2 小鼠胚胎成纤维细胞的生长行为
微信双开怎么弄小鼠胚胎成纤维细胞生长迅速、排列有序，贴壁后呈梭形、不规则三角形，多分支，在倒置显微镜下可见细胞核较大，细胞界限清晰。用胰酶消化后，细胞伪足收缩，呈圆形，明显比ES 细胞大。随着培养时间的延长，细胞密度加大，由于接触抑制，小鼠胚胎成纤维细胞增殖速度减慢；如果不及时传代，继续培养则死亡细胞数量增多、单层细胞卷起。同时，我们发现neo +/+、neo +/ 和neo / 的小鼠胚胎成纤维细胞生长行为没有明显差别。
2.3 滋养层细胞对ES 细胞生长的支持作用
丝裂霉素C 处理后的小鼠胚胎成纤维细胞停止分裂但并没有死亡，仍然能够很好地贴壁，这种滋养层细胞解冻后能维持12周，并能有效支持ES 细胞的生长、增殖(图2)。在滋养层上生长的ES 细胞核大、胞浆少，细胞排列致密，呈集落形状生长。ES 细胞克隆周围平滑，显微镜下观察有很强的立体感，胰酶消化后,ES 细胞透亮、小而圆，而消化下来滋养层细胞个体大、边缘有粗糙感，很容易和ES 细胞区
分开来。
图2 小鼠胚胎成纤维细胞滋养层上的TC 1ES
细胞(#200)
在用G418筛选中靶ES 细胞克隆的过程中，添加选择培养基(G418浓度280 g/ml)后,ES 细胞开始陆续
死亡，每天换液时可以见到许多飘浮的ES 细胞，到第7天，可以开始挑选存活的ES 细胞克隆作进一步的鉴定，在此期间滋养层细胞没有脱落和死亡，说明我们制备的滋养层细胞确实具有G418抗性，能够应用于中靶E S 细胞的挑选和培养。
[参考文献]
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手绘插画
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(本文编辑 杨兆弘)
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第1期 周 江，等 G418抗性的小鼠胚胎干细胞滋养层的制备
