Quantity One使用教程大全（转贴）
1 - 内容简介
凝胶电泳是每个做分子生物学的同学天天都要打交道的基本技术。电泳之后的信息处理与电泳本身同样重要。目前有大量软件可以用于分析电泳结果，比较有名的比如BandScan、BandLeader、Sigma Gel等等。今天要向大家介绍的是来自Bio-Rad的1D凝胶定量软件Quantity One（Bio-Rad还有一个做2D凝胶分析的软件咳特灵胶囊PDQuest）。这个软件的最新版本可以在Bio-Rad的主页免费下载。目前的最新版本是4.52版
2 - Quantity One的定量方法
Quantity One的分析功能顾名思义主要用来进行凝胶或者培养皿的荧光定量分析。它的分析功能或者说分析方式主要有4种：泳道/条带轨迹定量法；等高线直接定量法；菌落计数；分子量测定。这三种方法中使用最为方便也是最为广泛的应该是等高线定量法（Volumn Contour）。它通过半自动描绘电泳条带的等高线边缘来得到等高线区域内部面积，再将该面积乘以区域内平均光密度值得到条带内部总的信号量。当然这种分析方法的弊病显而易见：
无法同等得排除不同泳道的背景亮度；等高线的绘制处于“半自动”状态，即需要人为判断作为等高线标准的电泳条带的边缘；最致命的是在几个电泳条带距离十分接近的时候几乎无法绘制单一条带的轮廓（常出现连续的几个条带等高线相连而无法分离出单独条带的轮廓）。
三种方法中个人感觉最为科学和严谨的应该是泳道/条带轨迹定量法（Trace Tracking）。这种方法使用起来步骤较为繁琐，必须通过泳道识别---电泳条带识别两个连续的步骤才能进行定量。然而这种方式的最大优点在于它可以完全抛弃人为主观因素进行全自动定量。他的定量方式为：
首先根据不同电泳条带的光密度值绘制光密度曲线，然后计算光密度曲线下面积作为电泳条带的定量根据。大家可能会问他能不能排除泳道背景？答案是肯定的，它能够最大程度的排除不同泳道之间的背景差异，让各个泳道上的不同电泳条带在一条几乎相同的起跑线上进行对比。这个背景排除功能是等高线法无法做到的（等高线法也有基本的背景排除办法，但是和泳道/条带轨迹定量法的背景排除不是一个等级的。等高线法只能排除同一泳道上的背景，而不能均等的排除不同泳道的背景）。另外泳道/条带轨迹定量法还可以结合G
auss Model Bands对紧密相连的电泳条带进行分析，而这种条带也是等高线法无法分析的。我们此次重点学习这个方法。
第三个分析功能是菌落计数（Colony Counting）。这个功能其实很实用，可以分析蓝白筛选的结果。但是很奇怪我的电脑居然无法运行这个功能， 方下巴因此无法向大家介绍了。
另外Quantity One还可以通过回归曲线测定分子量。
3 - Quantity One的基本常用菜单操作
下面让我们了解一下Quantity One常用的基本菜单操作。
打开文件：由于Quantity One是Bio-Rad的硬件配套软件，因此Quantity One可以自动输入来自Bio-Rad公司的凝胶分析仪的数据。具体支持哪些硬件大家可以在“Edit-Preference-Imagers”里面设置。如果您的实验室没有采用Bio-Rad的硬件设施也没关系。您只要将电泳图片用ACDSee等程序转换为TIF图片格式就可以被Quantity One识别了。
注意Quantity One只支持8位和16位灰度的TIF文件。
Quantity One似乎有一个小bug，就是在按“Open”之后并没有立刻弹出资源管理器让你选择目标文件的位置。其实你只要将鼠标在屏幕右下方点击一下，资源管理器就会乖乖弹出来了.
Quantity One只能分析白色背景+黑色条带的电泳图。而我们正常情况下得到的一般都是黑色背景+白色条带的电泳图。我们可以在“Image-Invert data中将图片色彩进行反转，然后便可以用Quantity One进行分析了.
亲亲别再假正经
文字注释：Quantity One提供基本的文字注释功能。您可以在您的电泳图片上记录您的分析结果比如电泳条带的分子量、光密度值、物质的量等等。这个功能可以通过“Edit-Text O
verlay Tools”来实现。在弹出的浮动工具栏中选择“ABC”或者“”就可以进行文字输入和画标记线的操作。
光密度工具：在“View-Plot Density”的下级菜单中大家会见到几个和电泳条带光密度值相关的显示选项。大家可以分别选择不同的选项感受一下它们之间的差别。选择方法是点击相应的下级菜单比如“Plot Cross Section”，然后将变成带一个蓝色感叹号的鼠标移到您想知道光密度的位置，点击一下就会显示该处的光密度相关信息。在下面这幅图片中我们可以看见两条黄线交叉处的电泳条带的相关信息。上方的一串曲线是不同泳道之间在同一水平线上的光密度比值曲线；左边是黄线交叉处所在泳道的几个电泳条带的光密度分布情况。
3D Viewer：在“View-3D Viewer”菜单中大家会看到一个有趣的功能叫做3D Viewer。这个玩意按照Bio-Rad的说法可以辅助辨别几条紧密相连在一起的电泳条带的分布情况。大家只要选择了这个命令后鼠标就会一个“+”型，然后将+型移动到您感兴趣的位置，拖动鼠标画出一个正方形区域，然后用鼠标双击，Quantity One就会将这块区域按照gauss分布规律渲染成一个三维模型，颇有意思。但个人感觉这个功能噱头多于实用。
4 - Quantity One的基本背景排除功能从未离开过
休闲钓鱼最开始的时候我们就说过Quantity One的等高线定量模式也有一种比较基本的背景排除方法。这个方法同样也适用于泳道/条带定量模式。现在我们就来学习这个方法。基本背景排除的功能位于“”和“”这两个菜单。
Image-Filter Wizard：这个功能是对原始图片做一些初步的加工，主要是除去一些图片上的“斑点”。这些斑点主要有两种类型：一种是深色的“胡椒面”型和浅色的“食盐”型，两种斑点都可以毫不犹豫地去除。从“”菜单调出向导菜单后选择“pepper”和“salt”，下面两个选项可以按照程序默认的选项，然后“OK”就可以完成
这第一步的降噪过程。
Image-Substract backgroud：这个功能是真正对图片背景进行清理的工具（区别于“”的降噪模式）。只是这种清理是一种“全局”型的清理，即它以相同的参数对每条泳道进行背景清理。然而在清理方式上它还是可以分成两种不同的方式：
Backgroud Box：一种是以一个局部小面积为标准背景，将整张电泳图片上所有比该区域光密度值低的区域全部漂白。这种发式称为“Backgroud Box”。操作时用鼠标选中对话框下
部左侧的“Backgroud Box”八哥和鹦鹉的区别按钮，然后用鼠标在电泳图片上选择一块色彩接近于背景色，色泽比较均匀的区域，用鼠标拖动画出一个正方形。释放鼠标后程序就会立即对电泳图片进行降低背景的处理；
Backgroud Stripe：相对于“Backgroud Box”来说是一种更加智能化的处理方式。它特别适用于梯度凝胶，即凝胶浓度由上至下依次变化。由于梯度胶的光密度值在一定距离内不断变化，因此如果采用“Backgroud Box”的方法除背景就会发生偏差。Quantity One此时提供一种随着凝胶浓度变化而变化的除背景方式就是“Backgroud Stripe”。和“Backgroud Box”类似，选择右下角的“Backgroud Stripe”按钮，然后用鼠标沿着电泳泳道拖放形成一个狭长的剪影带（Stripe），这个剪影带内部的光密度值顺着泳道逐渐升高或降低。Quantity One根据这个Stripe可以动态的对整张图片的背景进行剪影。比如泳道起始处光密度低，那么Quantity One在此处的剪影值也降低；随着Stripe向前延伸，光密度值逐渐升高，Quantity One也同样不断加大剪影的强度。这样一来就可以排除由于梯度胶带来的背景不一致的影响因素。
狼性管理
5 - Quantity One的电泳泳道分析功能---创建泳道
前面说过Quantity One之所以强大是因为它具有的泳道/条带轨迹定量法。现在我们就来学习一下如何在电泳图片上创建泳道（Lane）以及如何进行针对不同泳道的背景排除。
创建泳道：首先打开我们要分析的电泳图片（以蛋白质电泳为例）。然后选择“Lane-Auto Frame lanes”。这时如果您的电泳图片比较标准的话，Quantity One就会自动识别出每条电泳泳道的位置，而且将各个泳道的路径用一条红线标画出来；
如果您对软件自动标记的泳道不甚满意，您可以通过“Lane-Edit Frame”下级各个子菜单提供的功能对泳道框架位置、大小等进行调节。调节方法就是通过鼠标的拖放来实现，大家可以自己体验一下；
如果您只需要分析其中几个泳道的数据而不想其他泳道的标记干扰您的视线，您可以通过“Lane-Single Lane-Remove Lane”删除您不需要的泳道的标记。
不是所有的电泳图片的泳道都能够被Quantity One自动识别。在不能自动识别的情况下，Quantity One就会弹出对话框告诉您它不能识别泳道。这时大家就需要手工绘制电泳泳道。方法和上面一样，同过“Lane-SingleLane-Creat Lane”来实现。只要用鼠标在您的电泳图片上顺着待标记的泳道的中轴线拖放就可以绘制出该泳道的标记红线
6 - Quantity One的电泳泳道分析功能---排除背景
前面说过Quantity One之所以强大是因为它具有的泳道/条带轨迹定量法。现在我们就来学习一下如何在电泳图片上创建泳道（Lane）以及如何进行针对不同泳道的背景排除。
排除背景：首先请大家注意，这个排除背景和前面我们在“Image”菜单中使用的“Substruct Backgroud”有所不同。后者排除背景的对象是整个电泳图片而非将各个电泳泳道的背景分别进行排除。现在我们要学习的这个命令可以帮助我们分别排除各个泳道（也可以将全部泳道用相同标准进行排除）的不同的光密度背景。这个功能对我们以后的分析影响甚大，大家一定好好学习。
首先我们要将我们的电泳图片进行前面谈到的泳道识别，不管是自动方式还是手工识别。然后选择“”命令。选择该命令后，鼠标即变成一个绿色的“+”，将鼠标移到您打算进行背景排除的泳道（比如下图中的第4泳道），点击左键一下，立刻就会弹出如下图所示的对话框。
其中“Optical Density”显示得是该泳道光密度值的分布情况。大家会注意到这个分布曲线并
不是紧贴着纵轴，而是位于纵轴上方分布。造成这个“悬空现象”的原因就是该泳道自身存在着一定的光密度“背景”。这个背景的存在导致该泳道上各个电泳条带之间不能处于同一水平进行对比；如果考虑到相邻的其他泳道更是因为不同背景的存在而无法对比不同泳道上的不同电泳条带。如何去除这个背景呢？我们继续看右边的“Lane Backgroud Substruction”对话框。这个对话框的上方“All Lanes”表示可以对所有泳道进行一次性处理；下方的“Selected Lane”表示仅针对此次选中的这个泳道进行处理（我们选中的是第4泳道）。我们用鼠标选择“Selected Lane”的“Lane On”选项。然后在下面的“Rolling Disk Size”里填上“简笔笑画5”，再按“回车”键。好！大家再来看看现在“Optical Density”中出现了一条紧紧沿着光密度曲线分布的酱色曲线。这条曲线将泳道的背景与电泳条带的光密度分布十分精确的划分开来。
