山西医科大学学报，2021年5月，第52卷第5期-534-
TRIM22在神经胶质瘤中致癌作用的机制研究
刘华锋4王超1*，张伟1，张明2，夏毅1(空军军医大学唐都医院神经外科，西安710438；5陕西省康复医院病 理科；*通讯作者，E-mail:)
摘要：目的探讨TRIM22在胶质瘤中的表达模式及功能。方法收集34例胶质瘤患者的胶质瘤组织以及胶质瘤旁正常组织，并通过qRT-PCR和Western bloWina检测TRIM22在胶质瘤组织和细胞系中的表达情况。为验证敲除TRIM22基因对U87细胞的增殖、迁移和侵袭的影响，将实验分为3组：Cw-shRNA组、6只"人21<1皿22组和6只"人21<1122+Libi组。Cox-6RNA组细胞共转染pMSCV-TRIM55质粒和对照6RNA,1hRNADRIM22组细胞共转染PMSCV-TRIM22质粒和6-TRIM22, 6只"人21<1皿22+Libi组细胞共转染14jmo/B Libi+pMSCV-PRIM55质粒和63只1皿22。通过CCK-3比色法测定细胞增殖；Trayswel i分析细胞的迁移和侵袭情况;Western blot/nv检测上皮-间充质转化过程(EMT过程)标志蛋白(E-3aPhe/b和▼61 extin)和Wyt/p-3atexm通路标志蛋白(cychnDl和c-Myc蛋白)的表达水平。结果与胶质瘤旁正常组织相比，胶质瘤患者组织样本中TRIM22蛋白和mRNA的表达水平均显著提高(P<4.41)。与Cox-shRNA组相比，6只"人2<1122组U87细胞中TRIM22的mRNA和蛋白表达水平均显著降低(P<4.01)；EMT过程标志蛋白E-3aPhe/b的表达水平显著升高(P<4.01), Vimex/b蛋白表达水平显著降低(P<4.41)U87细胞的增殖、
迁移和侵袭能力均显著降低(P<4.45)。与Cox-shRNA组相比，6RNA-TRIM22组U87细胞中cyOiDl和o-Myo蛋白的表达水平显著降低(P<4.01)；与6RNA-TRIM22组相比，-RNA-TRIM22+LiCl组U87细胞中cyc/nD1和c-Myc蛋白的表达水平显著升高(P<4.41),U87细胞的增殖、迁移和侵袭能力均显著升高(P<4.41)o结论TRIM22基因敲除抑制了U87细胞的增殖、迁移、侵袭和EMT过程，提示TRIM22在胶质瘤中可能是一个潜在的致癌基因。
关键词：TRIM22；神经胶质瘤；致癌作用
中图分类号：R739.4文献标志码：A文章编号：1027-6611(2221)25-2539-27DOI：12.13753/j.imn.1027-6611.2221.25.024
Stody on ccrcinooecic mechanism of TRIM22in glioma
LIA Huafexa1,WANG Chao1*,ZHANG Wei1,ZHANG Minx5,XIA Yi1(1D enartmegt of Neurosuryera,Tangdu Hospital,Ah Fora Military Medicdt Unwersita,Xi'g712030,China；2Departmeoi of PatOolofy,Shaanxi Prfincial Redabilitatiol Hospital；*Correspong-ing autaoe,E-mait:)
蜜蜡鉴别Abstrcct:Objecties To invesPpate the expressiox pattern and firnctiox of TRIM22in g/omasc Metaols
The glioma tissues and yormai tissues abjacext to glioma from34glioma pabexts were coWected.The expressiox of TRIM22in glioma tissues and cell/x3s was detected by qRT-PCR and Western blot/ngi Ix order to veV—the eVect of TRIM22gexe knochont ox proliferatiox,miprabox and ixva-siox of U87cells,the experimext was divided into three groups:Cox-shRNA group,shRNA-TRIM22group and shRNA-TRIM22+LiCi groupc The cells were cc-transfected with pMSCV-TRIM22plasmid and coxtroi shRNA in Cox-shRNA groupc The cells in shRNA-TRIM22group were cc-transfected with pMSCV-TRIM22plasmid—d6-TRIM22.The cells in sPRNA-TRIM22+LiCi group were
/ansfected with14jmol/B LiCi+pMSCV-TRIM22plasmid and sh-TRIM22.CCK-3colorimetric assay was ud to detect the cell pro-lifera/ox,TraxsweV analysis was ud to evaluate the cell migratiox and ixvasiox,and Western blotting was ud to detect the expressiox of E-caPhe/n and Vimextin in EMT,and CycOnDl and c-Myc in闪//0-281631pathway.Resulta Compared with xormai tissues abjacext to glioma,the protein and mRNA expressiox levels of TRIM22in cancer tissue from glioma patiexts were significanOy incread(P<4.41)c Compared with Cox-shRNA group,the mRNA and protein expressiox levels of TRIM22in U87cells were sianifi-canOy decread in shRNA-TRIM22group(P<4.01),the protein expressiox level of E-caPhe/n was iycread significan/y(P< 4.01),
and the protein expressiox level of Vimextin was significanOy decread(P<4.41).Compared with Cox-shRNA group ,the proliferabox,migratiox and ixvasiox abiliCes of U87cells in shRNA-TRIM22group were significanOy decread(P<4.05).Compared with Cox-shRNA group,the protein expressiox levels of cyclinDl and c-Myc in U87cells were significanOy decread in shRNA-TRIM22group(P<4.01)c Compared with shRNA-TRIM22group,the protein expressiox levels of cyclinDl and c-Myc in U87cells were significanOy ixcread in shRNA-TRIM22+LiCi group(P<4.01),and the proliferatiox,migratiox and ixvasiox abilities of U87
基金项目：国家自然科学基金青年科学基金项目（81541115）
作者简介：刘华锋，男,1077-45生，学士，主治医师,
收稿日期：2020-12-03
-544-J Shanxi Med Unia,May2221,Vol52No5
cells were significanUu incread(P<2.21)0Conclusion TRIM22fenc knochort can inhidit the proliferation,m/ration,invasion and EMT process of U87cells,suavest/g that TRIM22may bc a potential0/00/6x0in fioma.
Key words：TRIM22；glioma；。8、/0/6—$匚-
神经胶质瘤是中枢神经系统肿瘤中的一种高异质性肿瘤，起源于脑内胶质细胞[1]o大多数神经胶质瘤，即弥漫性神经胶质瘤，在中枢神经系统实质中显示出广泛的浸润；约占所有恶性脑肿瘤中的88%[2]o弥漫性神经胶质瘤根据世界卫生组织
（WHO）进一步分为I级（低级）、皿级（间变性）或
W级（胶质母细胞瘤）的星形胶质细胞，少突胶质细胞或罕见的混合少突胶质细胞-星形胶质细胞⑶o
目前治疗胶质瘤的方法多样，一般都是结合手术加放疗或化疗的综合治疗方案。然而胶质瘤的复发率高，虽然可通过磁共振成像进行检测，但它只能在宏观水平上显示肿瘤，所以仍需要探索一种新的治疗胶质瘤的方法。
含3个motif基序（tupartita motif,TRIM）家族有
77多个成员；它们的共同结构特征是保守的RING 指、B-2oe和卷曲螺旋结构域⑷。据文献报道,TRIM 蛋白对细胞增殖、分化和凋亡、调节其他基因的转录以及参与蛋白质的泛素化有很大作用⑸。TRIM家族的TRIM31是TRIM家族的一员，是E3泛素蛋白连接酶，最初被鉴定为由生长抑制性类维生素A诱导的基因⑷。据文献报道,TRIM在肿瘤进展中起作用，例如促进结直肠癌、胆囊癌和肝细胞癌的生长，
同时可以抑制非小细胞肺癌的癌变o然而，目前对TRIM在神经胶质瘤发展中的分子机制研究较少，本研究旨在探讨TRIM22在胶质瘤中的表达模式及其功能。
1材料和方法
1.2材料和组织样本
本实验所用细胞系HEB、A172、U251和U87均购自美国ATCC菌株保存库；DMEM培养基、Tizol 试剂盒、cDNA逆转录试剂盒、SYBR®Green PCR Mastao Mia试剂盒、BCA蛋白分析试剂盒、化学增光剂和细胞计数试剂盒-8购于Thermc fishao公司（美国）；RICA裂解缓冲液购于Inv/uex公司（美国）；—抗和二抗购于Sigma（美国）、Thermo fishao （美国）和Abeam公司（英国）；TRIM22的shRNA序列由上海生工生物有限公司（中国）合成；嘌吟霉素购于Sigma公司（美国）；Trausweli板购于Coming 公司（美国）。
本研究收集了2218年5月至2022年3月在唐都医院接受手术治疗的32例胶质瘤患者的胶质瘤组织以及胶质瘤旁正常组织，患者的平均年龄为44.35±2.67岁。本研究严格按照美国国立卫生研究院（NIH）出版物“实验标本组织提取使用指南”
进行，并经本院伦理委员会批准（No.2018-3-16-SW0181），所有患者均被告知并签署了知情同意书。
1.2细胞培养和qRT-PC R分析
正常小胶质细胞系HEB和胶质瘤细胞系A272、U252、U87均在含10%胎牛血清和1%青霉素/链霉素的Dulbecca改良Eagia培养基（DMEM）中培养，其培养环境为37°C、5%CO；根据细胞培养特性，每2-3d更换1次培养基。
根据说明书，采用Trizol试剂盒提取胶质瘤组织、癌旁正常组织和细胞的总RNA，采用液氮预冷研钵，组织样品或细胞沉淀放入加入含有液氮的研钵中，进行充分研磨；然后将研磨后的样品转染含Trizol裂解液的EP管中剧烈震荡并混匀，于室温放置5min。离心取上清，并采用氯仿/异戊醇的方法抽提RNA o将提取的RNA采用cDNA逆转录试剂盒合成cDNA o使用SYBR®Green PCR Mastao Mia 试剂盒在ABI-7300序列检测系统上定量TRIM22 mRNA表达水平。所用引物见表2o以GAPDH为参照基因，用2法计算TRIM22与GAPDH的相对mRNA表达水平
2.3Western blotting分析TRIM22、E-cadhedd、V1-mexUd、cyc/u D2和cMyo蛋白表达水平
使用RICA裂解缓冲液提取胶质瘤组织样本和细胞中的总蛋白；采用BCA蛋白分析试剂盒测定提取总蛋白的浓度。将蛋白质与2x上样缓冲液混合，于沸水浴1m/后制成上样样品；使用1%十表1qRT-PCR分析序所需引物序列
Tabie1Primee quenca required foe RT-PCR analysis 引物名称引物序列
TRIM22-P5'-ACGCTCATCTCAGATCTC-3'
TRIM22-R5'-TTTGGCTTTTCAATGTCCA-3'
GAPDH-P5'-ATCCCATCACCATCTTC-3'
GAPDH-R5-GGCTGTGTCATACTT-3
山西医科大学学报，2221年5月，第52卷第5期-541-
二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白（上样量大约为25隅），然后转膜至PMDF膜上。随后，在室温下用5%脱脂牛奶封闭PMDF膜1h o将膜与抗TRIM22（1：2000）、E-钙粘连蛋白（E-cad-hedd,:2000）、波形蛋白（Vi/entin,:2000）、细胞周期蛋白D1（cyc/u D1,1：2000）、cMyo（1：2000）或0-肌动蛋白（0-acUu,1：500）的一抗在4C下孵育过夜，然后将膜先利用TBST洗膜3次，每次1min；再将膜与各自的辣根过氧化物酶（HPR）偶联的二抗（1:2000）于室温孵育2h o最后通过使用化学增光剂（ECL）及检测软件（Bia-Rad公司）分析条带强度。
1.2sh-TRIM22转染及分组
通过将PCR扩增的全长TRIM22cDNA克隆到pMSCV逆转录病毒载体中，构建TRIM22的过表达质粒。
sh-TRIM22的序列：5,-UAAGCUGGCCUCUs UGACUAUC-3,；对照shRNA的序列：-CCCCU-UUUAAAAAAAGGGGCCCGG-3；将yMSCV-TRIM22质粒和sh-TRIM22或对照shRNA共转染U87细胞；其转染方法采用Lipofectamiua2200进行细胞瞬时转染实验。根据以上实验需求，为验证敲除TRIM22基因后，寸U87细胞的增殖、迁移和侵袭的影响，将实验分为3组：Cor-shRNA组、shRNA-TRIM22组和shRNA-TRIM22+Li/i组。Cor-shRNA 组细胞共转染pMSCV-TRIM22质粒和对照shRNA, shRNA-TRIM22组细胞共转染pMSCV-TRIM22质粒和sh-TRIM22,shRNA-TRIM22+Li/i组细胞共转染1p,mol/L Li/i+pMSCV-TRIM22质粒和sh-TRIM22（作为激活剂组）。爱国主题的手抄报
1.0细胞增殖实验
根据使用说明书，利用细胞计数试剂盒-8（CCK-8）法检测细胞增殖。将U87细胞接种于99孔板中，当细胞密度为1x104个/孔时，分别于0, 12,24,36,48,52h加入1mi CCK-8溶液,37C孵育1X后，使用Thermo酶标仪在452nm波长处测定吸光度。
1.2细胞迁移和侵袭分析
使用孔径为8mm的Transweli板进行TransweX 试验，并检测细胞侵袭和迁移能力。将每毫升含1x15个U87细胞浓度的DMEM培养基（不含FBS，大约为10»i）加入Transweli板上室，包被基质（用于侵袭实验）或不包被基质（用于迁移实验）o 下室加入含1%FBS的DMEM培养基。在孵育24h后，去除顶
部（未迁移）细胞，用4%甲醇处理22 min，再用0.2%结晶紫染色1m/o最后在显微镜（Nikon）下随机选择5个区域，并进行细胞计数，计算平均细胞数量。
H统计学分析
采用SPSS21.2进行数据统计分析，所有数据均以t±s表示，所有实验均独立进行至少3次。当数据符合正态分布后，两组间差异采用Student's t 检验，多组间差异采用单因素方差分析检验。P< 0.05表示差异具有统计学意义。
2结果
2.1TRIM22在胶质瘤患者组织样本和细胞系中高表达
与胶质瘤旁正常组织相比，胶质瘤患者组织样本中TRIM22的mRNA和蛋白表达水平均显著升高（P<0.21）o与正常小胶质细胞系HEB细胞相比，胶质瘤细胞系A172、U251和U87中TRIM22的mRNA 和蛋白表达水平显著升高（均P<0-01，见图1），其中U87细胞系差异性最为显著，后续实验选择U87细胞系为研究对象。
2.2沉默TRIM22抑制胶质瘤细胞增殖
qRT-PCR和Westeo blotting结果表明，与Cor-shRNA组相比，shRNA-TRIM22组U87细胞中TRIM22的mRNA和蛋白表达水平均显著降低（P< 0.21）o CCK-8比色法检测细胞增殖结果表明，与Cor-shRNA组相比，shRNA-TRIM22组U87细胞的增殖显著降低（P<0.05，见图2）o
2.3沉默TRIM22抑制胶质瘤细胞的迁移和侵袭
与Cor-shRNA组相比，shRNA-TRIM22组U87细胞迁移和侵袭能力显著降低（P<0-21，见图3）o 这表明，沉默TRIM22可显著抑制U87细胞的迁移和侵袭。
2.0沉默TRIM22抑制胶质瘤细胞上皮-间充质转化（EMT）过程
与Cor-shRNA组相比，shRNA-TRIM22组U87细胞的EMT过程标志蛋白E-cadheriu的表达水平显著升高,Vi/extiu蛋白表达水平显著降低（P< 0-21，见图4）o
・542J Shanxi Med Univ , Mcy 2021, Vol 52 No 5
与胶质瘤旁正常组织相比,P < 0・05；与正常小胶质细胞系HEB 细胞相比,P < 0. 05, *P < 0. 01
图1 TRIM22在胶质瘤患者组织样本和细胞系的表达情况
Figure 1 Expression of TRIM22 in gliomc tissces anf cell lines
西字加偏旁
*«*
fc ^V N H W
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Con-shRNA shRNA-TRIM22
A, RT-PCR 检测 TRIM22 在 U87 细胞中的表达
1. Con-shRNA Figure 2
E l
早
g n z w I H H
1 2
TRIM22
C. CCK-8比色法测定U87细胞增殖情况
B, Westero blotting 检测 TRIM22 在U87细胞中的表达
台湾的景点
；2. shRNA-TRIM22；与 Cor-shRNA 组相比,*P<2. 25, *P <2. 21
图2 沉默TRIM22抑制U87细胞增殖
生日祝福语小朋友Silencing of TRIM22 infibits tfe pmlifemtion of U87 cel-s
2. 5 沉默TRIM22抑制胶质瘤细胞 Wnt/0-cPenin 通路的激活
Westeo blotting 结果表明，与 Con-shRNA 组相
比，shRNA-TRIM22 组 U87 细胞中 cyc/nD1 和 c-Mye
蛋白的表达水平显著降低（P < 5 21）；与shRNA- TRIM22 组相比，shRNA-TRIM22 + Li/i 组 U87 细胞
中cyc/nD1和e-Mye 蛋白的表达水平显著提咼（P < 2.21，见图 5）o 与 Con-shRNA 组相比，shRNA- TRIM22组U87细胞的增殖、迁移和侵袭受到显著
抑制；与 shRNA-TRIM22 组相比，shRNA-TRIM22 + L/C 组U87细胞的增殖、迁移和侵袭能力均显著
升
高（PV2.21，见图 6）
o
山西医科大学学报，2021年5月，第52卷第5期-543-
特价图片
A.Tmnswel）法检测此7细胞的迁移（X102）
B.Tmnswel）法检测此7细胞的侵袭（X102）
与Cox-s/RNA组相比,**P<2.21
图3沉默TRIM22可抑制U^细胞的迁移和侵袭
鱼儿
Figure3Sileocing of TRIM22inhibits migmtiox an/invesiox of UK cells
Con-shRNA shRNA-TRIM22
与Cox-s/RNA组相比，"P<2.21
图4沉默TRIM22抑制了民7细胞中的EMT过程
Figure4Sileocing of TRIM22in/ibits EMT in UK cells
123123
化学英文cyclin DI——c-Myc
R-apt i n R-aptiri
卜丿丄丄丄卜丿di/1丄丄丄
1.Cox-s/RNAs/RNA-DRIM22；3.shRNA-TRIM22+Lib)-与Cox-s/RNA组相比,**P<
2.01；
与s/RNA-TRIM22组相比,##P<2.01
图5沉默TRIM22可抑制此7细胞Wvt/p-zateoin通路的激活
Figure5Sileocing of TRIM22in/ibits the activatiox of Wnt/p-zateoin pathway in UK cells
