烟草细胞质雄性不育系SK01的胞质效应及特异性分子标记
作者：刘艳芳，刘志文，孙玉合，杨爱国，李凤霞
来源：《中国烟草科学》2021年第05期
择组词语
摘 要：為了鉴定项目组发现的K326雄性不育自然突变株SK01与生产应用的不育胞质sua-CMS的异同，分析其在烟草育种和生产中的应用潜力，本研究以tab1-CMS不育系SK01和其同核异质系K326为母本，分别与4个烤烟品种杂交构建2组F1代杂交种，在两个地点和人工气候室中比较8个F1代以及SK01和K326之间的主要农艺性状和抗病性差异，开展了tab1-CMS特异的DNA标记筛选。结果表明，SK01细胞质增强烟草杂交种F1代对CMV
1970年属相、黑胫病的抗性，对株高、茎围等农艺性状以及PVY、TMV抗性无显著的细胞质效应;叶绿体基因组trnC-trnD基因区间，扩增到可有效区分烟草不育胞质类型的1个588 bp的特异性片段。本研究发现的不育胞质tab1-CMS与生产应用的sua-CMS类型不育系有明显差异，对农艺性状和抗病性无明显的不利影响，是一种有一定应用潜力的不育细胞质新突变类型。
关键词：烟草;细胞质雄性不育;农艺性状;抗病性;特征标记
Cytoplasmic Effects and Specific Molecular Markers of Tobacco Cytoplasmic Male Sterile Line SK01
LIU Yanfang1，2， LIU Zhiwen3， SUN Yuhe1， YANG Aiguo1， LI Fengxia1*
（1. Tobacco Rearch Institute of Chine Academy of Agricultural Sciences， Qingdao 266101， China; 2. Chine Academy of Agricultural Sciences， Beijing 100081， China; 3. East China Normal University， Shanghai 201100， China）
逼仄
Abstract： Cytoplasmic male sterile line （CMS line） is an effective genetic tool for
西装领带怎么打tobacco hybrid breeding. At prent， there is a single type of CMS ud in tobacco hybrid breeding in China. In order to identify the similarities and differences between the male sterile natural mutant SK01 and the sterile cytoplasm ud in production， and to analyze its application potential in tobacco breeding and production， tab1-CMS sterile line SK01 and its homokaryon heterogeneous line K326 were ud as the female parents in crossing with four flue-cured tobacco varieties to construct two ts of F1 hybrids. Eight F1 lines， SK01 and K326 were compared in two locations in the field or in artificial climate rooms. The main agronomic traits and dia resistance differences between tab1-CMS-specific DNA marker screening were carried out. The results showed that the SK01 cytoplasm enhanced the resistance of tobacco hybrid F1 to CMV and black shank， and had no significant cytoplasmic effect on resistance to PVY and TMV， plant height， stem circumference or other agronomic traits. A 588 bp specific fragment was amplified from the trnC-trnD gene interval of the chloroplast genome， to that can effectively distinguish the sterile cytoplasm of tobacco. It shows that the sterile cytoplasmic tab1-CMS identified in this study is significantly different from the sua-CMS t
ype sterile line ud in production and has no obvious adver effects on agronomic traits and dia resistance. It is a new type of cytoplasmicsterility with certain application potential.
Keywords： tobacco; cytoplasmic male sterility; agronomic traits; dia resistance; characteristic markers
细胞质雄性不育（cytoplasmic male sterility， CMS）是植物因雄蕊退化、花粉败育或功能不育等原因造成的雄蕊不能正常授粉而雌蕊功能正常的一种母性遗传性状。杂种优势是作物提高单产、改进品质、增强抗逆的重要途经[1]。利用雄性不育系生产杂交种可降低种子生产成本并保证种子的纯度，水稻、十字花科蔬菜等多种植物的杂交种在生产中具有重要地位。烟草（Nicotiana tabacum）杂种优势明显，杂种F1代在生长势、生长量、抗逆性以及品质等方面都比双亲平均值有明显提高[2]。杂交种逐渐成为烟草品种培育的趋势。目前烟草不育系和杂交种的种植面积占我国烤烟总面积的70%，但只有胞质来源于N. suavelens的sua-CMS类型不育系被广泛使用。作物长期使用单一不育胞质遗传基础脆弱，易受病害虫侵害，在生产上具有很大风险性。上世纪70年代美国玉米杂交种的不育胞
质几乎全部为T-CMS，由于T-CMS易感小斑病菌（Elminthosporium Maydis Shoemaker），造成了全美范围内玉米的严重减产，T胞质被停用[3]。因此，急需开展烟草不育胞质创制、鉴定和评价等研究，打破烟草杂交育种中长期、大面积使用单一不育胞质的局面。
由于核质互作的影响，不育细胞质对作物多种性状有显著的细胞质遗传效应[4]。水稻h2s细胞质对结实率、穗重、产量等性状具有显著的正效应[5-6]，棉花不育细胞质对产量性状具有明显负效应[7]。在抗病性方面，据水稻、小麦、油菜等作物的相关报道，不同细胞质对抗病性一般表现为负效应，但多个外源胞质在小麦抗病性上表现为正效应[8]。烟草不育细胞质对后代的影响研究表明，与对照相比，不育胞质来源于N. bigelovii、N. megalosiphon、N. plumbaginifolia的不育系有效叶数减少;不育胞质来源于N. undulata的不育系开花期推迟[2]，sua-CMS细胞質对烟草的农艺性状和品质性状没有显著的负效应[9]。
鉴定胞质雄性不育系类型的方法有形态学、细胞学和分子标记，其中分子标记是鉴定胞质雄性不育类型的主要方法[10-13]，包括线粒体特异基因[14-16]、线粒体/叶绿体简单序列重复（simple quence repeat， SSR）[17-19]、单核苷酸多态性（single nucleotide p
olymorphisms，SNP）[20-22]等。叶绿体是与CMS有关的一个细胞器，在叶绿体基因组的基因间区和内含子区有大量的SNP、InDel、易位、重复、点突变以及基因组结构变异，具有比核基因组更高的核苷酸替代率[23]，可用于区分细胞质雄性不育系[24-25]。叶绿体trnC-trnD约为3000 bp，包括trnC、petN、psbM、trnD 4个基因。该区域在多个物种中具有丰富的多态性，研究人员利用trnC-trnD序列构建了人参[26]、山矾属[27]等物种的系统发育树[28]。
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SK01（tab1-CMS）是2010年7月在K326的试验田中发现的一株雄性不育自然突变体，表现为完全败育。2011—2016年间在青岛和西昌两地连续8代对SK01进行K326回交，回交后代均表现雄性不育，且为细胞质雄性不育。
本研究以SK01（tab1-CMS）及其同核异质系K326为母本、4个烤烟品种为父本配制8个杂交组
合，由此产生5组成对的细胞核基因组相同而细胞质不同的杂交种，以此评价SK01不育细胞质在烟草主要农艺性状和抗病性等方面的胞质效应;通过比较tab1-CMS不育系、sua-CMS不育系及其可育对照的叶绿体trnC-trnD多态性，鉴定tab1-CMS的特定分子标记。
这将为丰富烟草不育胞质源及烟草优异不育胞质在育种和生产上使用奠定基础。
1 材料与方法
1.1 试验材料
1.1.1 植物材料 SK01（K326的同核异质系，tab1-CMS），可育对照K326，以及以SK01（S）和K326（F）为母本，以中烟100（M1），NC82（M2），红花大金元（M3）和Speight G-28（M4）为父本分别杂交的F1代。tab1-CMS组包括S以及S与M1-M4的4种杂交组合;对照组包括F以及F与M1-M4的杂交组合。
富含卵磷脂的食物
1.1.2 供试毒株及菌种 烟草花叶病毒（TMV）、黄瓜花叶病毒（CMV）、马铃薯Y病毒（PVY）、黑胫病菌种，均由中国农业科学院烟草研究所育种研究中心保存。
1.2 试验方法
真味如烟 1.2.1 农艺性状调查 在山东省诸城市（北纬35°95'，东经119°19'，海拔65 m）和四川省西昌市（北纬27°84′，东经102°37′，海拔2100 m）两个不同的烟草生态区分别种植SK0
1，K326和8个F1代杂交组合，采用完全随机区组设计，设置2次重复，每个重复50株，在50%植株中心开放时，每个重复选取长势相对均一的10个单株，按照烟草行业标准YC/T 142—2010测定株高、有效叶数、节距、茎围、最大叶叶长和最大叶叶宽[29]。
1.2.2 抗病性调查 抗性鉴定在中国农业科学院烟草研究所人工气候室进行，温度为25 ℃，湿度为60%，每个材料设2次重复，每个重复25株。
TMV、CMV、PVY的抗性鉴定：将新鲜繁毒叶片研磨、过滤，滤液经纯净水5倍比例稀释，待烟苗长至5～6片真叶时进行人工摩擦接种。接种30～35 d后，参照我国烟草病虫害分级及调查方法B/T23222—2008进行抗病性调查。病情等级划分为0、1、3、5、7、9六个等级。
七加一 黑胫病抗性鉴定：采用茎基部菌谷接种的方法，待烟苗长到4～5叶期时，在每株烟苗的茎基部用小刀轻轻划一条大小相同的伤口，然后在根部接种3～5 g菌谷，立即覆土并灌水保湿。接种3周后调查每株发病情况，病害分级按国家行业标准YC/T39—1996规定执行，病情等级划分为0、1、3、5、7、9六个等级。
细胞质雄性不育（cytoplasmic male sterility， CMS）是植物因雄蕊退化、花粉败育或功能不育等原因造成的雄蕊不能正常授粉而雌蕊功能正常的一种母性遗传性状。杂种优势是作物提高单产、改进品质、增强抗逆的重要途经[1]。利用雄性不育系生产杂交种可降低种子生产成本并保证种子的纯度，水稻、十字花科蔬菜等多种植物的杂交种在生产中具有重要地位。烟草（Nicotiana tabacum）杂种优势明显，杂种F1代在生长势、生长量、抗逆性以及品质等方面都比双亲平均值有明显提高[2]。杂交种逐渐成为烟草品种培育的趋势。目前烟草不育系和杂交种的种植面积占我国烤烟总面积的70%，但只有胞质来源于N. suavelens的sua-CMS类型不育系被广泛使用。作物长期使用单一不育胞质遗传基础脆弱，易受病害虫侵害，在生产上具有很大风险性。上世纪70年代美国玉米杂交种的不育胞质几乎全部为T-CMS，由于T-CMS易感小斑病菌（Elminthosporium Maydis Shoemaker），造成了全美范围内玉米的严重减产，T胞质被停用[3]。因此，急需开展烟草不育胞质创制、鉴定和评价等研究，打破烟草杂交育种中长期、大面积使用单一不育胞质的局面。
