安卡拉病毒PCR 检测方法的建立
李乔斌1 ，张
1 ,
玲1 , 筠2 ，李梅1 , 晓东1 ,
113
（1.贵州大学动物科学学院，贵州 贵阳550025 & 2.贵州省动物疫 防控制中心， 贵州贵阳550008 ； 3.贵州省动物疫病与兽医公共卫生重点实验室，贵州贵阳550025）
心包积液-肝炎综合征（Hydmp/memiumA/at titis syndamv ,HHS "最早发现于巴基斯坦安卡拉地
区， 称为安卡拉病， 的病原是禽
，而
引 状的属于I 群禽 ［1］，
要感染鸡群$ 感染 临床 理 征 要为 包积
液和肝炎，因，也称为HHS 先流行于
坦、印度、韩国
洲地区和秘鲁、智利、墨
洲地区。自2015年， 中国
份暴
发流行卩氨］，2016年 贵州省也先 出现
收稿日期：2019—11—18
基金项目：贵州省研究生教育创新计划项目（GZZ2017002）；贵
州省科技创新人才团队项目（黔科合人才团队［2015］4016号）
作者简介：李乔斌（1996 -），男（白族），硕士生，研究方向为预
防兽医学，E-mail ：1812679609@qq- com
摘要：由安卡拉病毒引起的鸡心包积液-肝炎综合征发病急，传播速度快，造成雏鸡的高死亡率$为快速确诊，实现早发
现早控制，本试验根据安卡拉病毒主要结构蛋白六邻体(Hexon)基因序列，设计1对特异性引物，优化反应体系，并对其进行
特异性、敏感性和临床样本检测，以期建立检测安卡拉病毒的PCR 方法。结果显示，可扩增出295 bp 特异性片段，最佳模板 质量浓度确定为4.38x 10-2PL ，最佳退火温度为58 k $该方法具有较好的特异性、灵敏性和临床应用性，可对临床/AdVA
感染病例作出快速检测，为疫病的快速鉴别诊断、及时防控提供参考价值。
关键词：安卡拉病毒；Hexon ; PCR ；检测方法
中图分类号：S855.3
文献标志码：A
文章编号：0529—6005(2020)11—0051—04
Establishment and Application of PCR Method for Ankara Virus
LI Qiao-bin 1，ZHANG Yun-dan 1，HE Ling 1，YUE Jun 2，LI Mei 1，XIL Xiav-dong 1，CHENG Zhen-tav 1，3
(1. Colleae of Anival Science ，Guizhou University ，Guiyang 550025 China ； 2. Animal Dia Prevention and Control Centes in Guizhou Province ，Guiyang 550008 ，China ； 3. Guizhou Key Laboatoa of Anival Epidemics and
Veterinaa Public Health ，Guiyang 550025 ，China )
Abstract : The chVken heart e/usion-hepaetis syndrome caud by the Ankara virus is acute and spreads quRkly ，msulting in a
high mortality rate for chicks. Tv achieve rapid diaynosis and early detection and control ， we desianed a pair of specific primers
bad on the quence of the main structural protein Hexon of Ankara virus ，optimized the reaction system ，and tested its specificity ，
nsitivity and clinical samples to establish a PCR method for detection of Ankara virus. The results showed that 295 bp specific fray-
me n t was amplified. The optimal template mass concentration was determined to be 4. 38 x 10 _2 gL ，and the optival annealing tem
perature was 58 k . This method h as good specificity ，nsitivity and clinical application ，and can be ud for rapid detection of
/AdVA infection in clinical cas.
Key words : Ankara virus ； Hexon ； PCR ； detection method
Corresconding author : CHENG Zhen-tao ，E-mail : chengzhentao@sohu. com
疑 ⑸。该病发急，传播 ，病死高，
死亡率为30% - 80%，临床 与其他禽类免疫性
生 ，引混合感染［6］，给
困难，因，
一种 、高效、特异的 I
杜甫的名诗方法显得十分必要。本试验基于I 群禽 血生物复习资料
4型(FAdV-4 ) hexon 基因，构建可
卡
拉 核酸的 方法，将为
原流行病学研
究、
机理研究、预警 报提
键技术。
1材料与方法
1-1毒株与样本FAdV-4标准毒株，由贵州福斯
特生物 提供$新城疫 (Newcestla
dia yirus ，NDV )、鸡痘病毒(Fowl pax yirus ，
FPV )、传染性支气管炎病毒(Inf/tNus bronchitis vi- rus ，ILV )和传染性法氏囊病病毒(Inf/tNus bursal
dReasa vims,ILDV )等疫苗，均购 州威克生物科
通讯作者：程振涛,E-mail : chengzhentao@ sohu. com
技有限公司；减蛋综合征病毒（Egg drop syndrome virus,EDSV）和H9亚型禽流感病毒（Avian infuenza virus,AIA）等疫苗，贵州生物科技提供。临床疑似HHS组织样本（肝脏）材料采集自贵州省某养鸡场$
1.2试剂RNA/DNA提取通用试剂盒、2X Taq PCR Master Mix、DL-2000DNA Maker，均购自天根生（北京）；他试剂均为国产分析纯$玄微子
1.3引物设计与合成根据安卡拉病毒主要结构蛋白六邻体（Hexon"基因序列，应用Primer Pemier 5.0软合成1对引物FAdVV F/R，引物序列见表1，期增大小为295bp，引物由生工生物工程（上海）股份合成$引物稀释成浓为10pmol/$L，于-20C保存备用$
表！引物信息
Table1Primer informatign
引物引物序列（5'73'预期扩增Lp Primers Primer quence Product length
FAdVF-F CGATTGTGTTACTAAACGGGT
295 FAdVF-R ACGCTCTAAGGGTTTACACGG
1.4FAdV-4PCR检测方法体系构建初步建立FAdV-4PCR检测方法25$L反应体系：DNA模板2$L,PCR Mio1
2.5$L，引物FAdVV-F/R各1$L, ddHO补足至25$L$PCR反应程序：94C5min；94C30s,58C30s,72C45s,35个循环；72C 10min$PCR产物于1.2%凝胶电泳观察。1.5PCR检测方法反应条件的优化以提取的FAdV-4DNA为模板，建立25$L PCR反应体系，分 别对模板、退进行。模板：DNA模板分别为2.19X10一2、4.38X10一2% 8.78x10一2g/L和1.76x10-g/L；退火温度梯度为：56C、58C、60C%62C和64C$涓
板和退的方案，确PCR反应$
1.6PCR方法的性能评估
1.6.1敏感性检测将提取的FAdVV DNA模板采用核初，按10倍梯度倍比稀释成10一1、10-2、10-3、10-4、10-5和10-6系梯度，应的PCR方法反应进行目的基因扩增，扩增物于1.2%的凝胶电泳观察结果，以出现DNA电泳条带为标准，评估方法的感性$
1.6.2特异性检测分别提取1.1中的疫苗株模板应的PCR方法进行的因增,
FAdV-4为阳性对照，为阴性对照。扩增产物于1.2%的凝胶电泳观察结果，评估该方法的异性$
1.6.3临床应用性检测取10份临床疑似病例肝脏组织提取DNA本，应的PCR方法进行的基因扩增，FAdVV标准本为阳性对照，去离子水为阴性对照。扩增产物于1.2%的凝胶电泳观察结果，评估该方法的临床应用效果。
2结果
2.1PCR方法体系的构建以初步建立的25$L 普通PCR反应体系和反应对目的基因进行PCR扩增,PCR产物电泳结果见图1$1可见，所的PCR反应体系能扩增出大约295bp的目的基因，与期相符$
十句关于勤奋好学的名言bp
2000
1000
750
500
250
100
M1234
图1FAdVV样本PCR检测
Fig.1Detection ot FAdVV samples by PCR M：DL-2000DNA marker；1〜3:FAdVV样本；4：阴性对照
M:DL-2000DNA marker；1-3:FAdVV samples；4:Negative control 2.2PCR反应条件的优化由图2可知，当模板质
释为2.19x10-2g/L时，扩增，当为4.38x10一2g/L时扩增明显，因此，最佳模板质量浓度确定为4.38X1
0-2g/L$由3可，在退为58C，扩增，随着高，减，因此最终确定58C为:
蛹虫草菌粉胶囊
退$
1000 750 500 250 100M1234
20&
图2模板质量浓度的优化
Fig.2Optimized of tomplato concentrotign M：DL-2000DNA marker；1〜4：模板浓度分别为2.19xl0「2%
4.38x10-2、8.78xl0「2g/C和1.76xl0「1g/C
M:DL-2000DNA marker；1〜4:The concentrations of
templates are2.19x10_2,4.38x10_2,
8.78xl0_2g/C and1.76x10_1g/C
bp
2000
1000
750
500
250
100
M12345
图3退火温度的优化
Fig.3Optimizatign of ann eail ng tomperaturo M：DL-2000DNA marker；1〜5：退火温度分别为
56%58%60%62°C和64°C
M:DL-2000DNA marker；1〜5:Annealing temperatures are
56,58,60,62C and64C
年会流程
2.3PCR方法性能评估
2.3.1PCR方法敏感性经核酸蛋白测定仪测定FAdV-4模板浓度为4-38x10-2g/L，以此模板浓度释至10一6倍，应PCR反应体系和反应
对10倍倍比稀释的系DNA样本进行，结果见图4$4可见，释倍数10-4还出现的扩增，至10-5释，无明显扩增
bp 2000 1000 750
500 250 100
bp
29S
图4敏感性检测
Fig.4Sensitive detoctio n
M:DL-2000DNA marker；1〜7：模板DNA稀释倍数分别为100%10-1%10-2%10-3%10-4%10-5%10-
6；8：阴性对照M:DL-2000DNA marker；1〜7:Template dilutions are100, 10_1,10_2,10_3,10_4,10_5and10_6；8:Neyative control 条带。因此，建立的PCR方法最低检测FAdW病毒核酸浓度为4.38x10-6g/C。
2-3-2PCR方法特异性由图5可见,FAdV-4核本扩增出与预期大小相符的，他6种
核本均无基因扩增，表明的PCR 方法好的特异性。
bp
2000
1000
750
500
250
100
M1234567
图5特异性检测
Fig.5Specificity detiction
M:DL-2000DNA marker；1：血清4型禽腺病毒；2：新城疫
病毒；3：鸡痘病毒；4：传染性支气管炎病毒；5：鸡传染性
法氏囊病病毒；6：减蛋综合征病毒；7:H9亚型禽流感病毒M：DL-2000DNA marker；1:FAdW；2:NDV；
3:FPV；4：IIV；5：IIDV；6:EDSV；7:A u H9subtype
2.3.3临床样本检测取10份临床疑似病例肝脏组织提取DNA样本，评估所建PCR方法的临床应性，结果见图6$6可见，除性对照外，10份样本中有6份样本扩增出与预期相符的目的条，性为60%（6/10），说明本试验的PCR方法可用于FAdW临床样本$
bp M+12345678910
图6临床样本检测
Fig.6Dettctign of clinicai samples
M:DL-2000DNAmaekee；+：性对照；
1-10：临床样本；-：阴性对照
M:DL-2000DNA marker；+:Positive control；
1-10:Clinical samples；-:Neyative control
3讨论
安卡拉病毒属于腺病毒科禽腺病毒属（I亚群禽）禽C种血清4型（FAdW）,
结态、性、理性等方面无法有效与其他禽另」。禽分为3个群！I、'、&）,5种（A-E）和12血
⑺。血禽间一定的免疫交叉反应，生交叉保护$因要实现各血禽所致疫病的及警和有效防控，仍需对各种禽出及效的$安
卡拉病毒感染主要引起心包积液和肝炎，还可引起蛋鸡产蛋下降。临床上安卡拉病毒病易与鸡包涵体
肝炎病混淆，且易与禽白血病、传染性法氏囊病、大肠杆菌病等混合感染这些因素导致难以基于临床症状对该病作出确切性诊断，因此，高效、快捷的实验室检测方法的建立对实现该病的早发现、早防控起到了关键作用[10]$鉴于本病在贵州省的流行现状，本文建立了可用于FAdV-4快速检测、组织嗜性、病毒含量等研究的检测方法，为安卡拉病毒病的诊断、研究提供了科学依据$
目前，可用于FAdV-4的检测方法有血凝(HA)和血凝抑制试验(HI)、酶联免疫吸附试验(ELISA)等血清学试验[11]$这些方法快速、操作简单，但易出现假阳性和交叉反应。基于PCR病原核酸检测的分子生物学方法具有快速、灵敏等优点，包括PCR检测技术、LAMP、q-PCR等，这些技术各有优缺点(12呵，均可用于检测FAdV-4。目前，安卡拉病毒检测尚无技术规范，但有研究针对安卡拉病毒Peetoo基因建立PCR检测方法[14]，而本试验基于安卡拉病毒Heoo基因，选择保守区域建立PCR检测技术，性能评价显示具有良好的特异性、敏感性，该方法不仅可用于病例的快速诊断，也可基于纤突蛋白的致病相关性开展病毒组织嗜性研究。PCR检测技术因具有特异性、敏感性，在医药卫生、农业科学和生物学等领域得到广泛应用[15]，本文建立的安卡拉病毒PCR检测方法性能分析也具有较好的敏感性，最低检测FAdV-4病毒核酸浓度为4.38X 10-6g/L，根据DNA拷贝数的计算公式，可得灵敏度为2.03X105拷贝/$L，较Brownia等[16〕建立的PCR检测灵敏度103-104拷贝/$L更敏感。本文在设计引物时，通过对不同血清型禽腺病毒Hexop基因进行序列比对，选择了609-904bp保守区域片段，具有血清型特异性，能有效区分不同禽腺病毒血清型，保障所建方法的特异性[17]$参考文献：
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