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荷花的样子收稿日期：2021-01-04
基金项目：广西科技重大专项（桂科AA17204028）；西藏农牧科学院省部共建青稞和牦牛种质资源与遗传改良国家重点实验室
开放项目（XZNKY-2020-C-007K05）
第一作者：贾银海（1977-），/0000-0002-5411-3620，博士，高级畜牧师，主要从事动物遗传育种与繁殖研究工作，
E-mail ：****************
基于TMT 蛋白组学及生物信息学分析牦牛
抗冻差异蛋白
贾银海1，张成福2，张强2，姬秋梅2，黄光云1，姜
辉2，文信旺1，
黄明光1，彭夏云1，吴柱月1
（1广西畜牧研究所/广西家畜遗传改良重点实验室，南宁
530001；2西藏农牧科学院畜牧兽医研究所/
省部共建青稞和牦牛种质资源与遗传改良国家重点实验室，拉萨读题
850000）
宝剑摘要：【目的】从蛋白水平阐明牦牛抗寒性能机理，并进一步从营养学角度提高其代谢性能，为牦牛有效抵御外界恶劣气候条件提供科学依据。【方法】应用TMT 蛋白组学技术对寒冷季节（1月）和温暖季节（8月）的牦牛抗冻蛋白进行挖掘，并对鉴定到的牦牛抗冻蛋白进行亚细胞定位、结构域、GO 功能富集、KEGG 信号通路注释、蛋白相互作用等生物信息学分析。【结果】从牦牛耳组织中共鉴定获得21856个肽段（Peptide ），其中特有肽段（Unique peptide ）序列为18452个，定量获得4519个蛋白，最终筛选出144个差异蛋白，其中上调蛋白89个、下调蛋白55个。144个牦牛抗冻差异蛋白亚细胞定位到7个条目上，分别是细胞核蛋白56个、细胞质蛋白51个、质膜蛋白24个、细胞外蛋白23个、线粒体蛋白18个、细胞骨架蛋白1个和溶酶体蛋白1个；共鉴定到194个结构域。GO 功能富集分析结果显示，生物过程主要富集到细胞过程蛋白79个、代谢过程蛋白70个和生物调控蛋白42个等，分
子功能主要富集到结合功能蛋白75个和催化活性蛋白64个等，细胞组分主要富集到细胞部分蛋白89个和细胞蛋白89个等。144个牦牛抗冻差异蛋白在KEGG 数据库中注释到205条KEGG 信号通路，主要涉及核糖体、氮代谢、胞质DNA 感受、动物体内生热作用、氧化磷酸化、白细胞介素-17及钙离子信号等通路。牦牛抗冻差异蛋白相互作用网络分析发现L8IHE5的关联度最高，且冷诱导RNA 结合蛋白（CIRP ）和HSP70结合蛋白在蛋白相互作用网络中具有更多的相互作用关系。【结论】基于TMT 蛋白组学对牦牛抗冻差异蛋白进行挖掘，结果鉴定获得144个抗冻差异蛋白（上调蛋白89个，下调蛋白55个），其中CIRP 和HSP70在冷应激条件下呈上调趋势，能促使牦牛肌体适应低温环境，可作为牦牛抗冻性育种的候选分子标记。
关键词：牦牛；TMT 蛋白组学；生物信息学；抗冻性；差异蛋白中图分类号：S823.85
文献标志码：A
文章编号：2095-1191（2022）01-0001-11
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贾银海（1977-），博士，高级畜牧师，主要从事动物遗传育种与繁殖研
究工作。先后主持或参与完成国家重点研发计划项目、中国科学院科技援藏项目、中国科学院科技援
疆项目、中国科学院科技支黔工程、云南省科技计划项目、广西科技重大专项等40余项，在家畜（肉牛、肉羊、牦牛及奶牛）等品种上开展了应激调控机制、营养代谢调控机制、胚胎工程技术和生态养殖等基础研究工作。荣获云南省科技进步奖二等奖2项，广西科技进步奖三等奖1项，昆明市科技进步奖二等奖1项，昆明市科技进步奖三等奖1项及广西南宁市科技成果登记10项；获授权专利18项，出版专著1部；在《Gene 》《Frontiers in Genetics 》《中国畜牧兽医》《南方农业学报》等国内外权威学术期刊发表科技论文60余篇。
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南方农业学报
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0引言
【研究意义】牦牛具有很强的抗逆能力，属于世界第三大极地动物，是当今世界未被污染的三大物种（北极熊、企鹅和牦牛）之一。青藏高原的牦牛数量占全球牦牛总量的90%以上。据统计，2018年青藏高原1.2亿ha的高寒草场上约有1600万头牦牛，是世界上重要的牦牛资源库和主要生产基地（郝力仕，2019）。在藏区牧民经济中，牦牛的乳、肉、皮、毛、绒及其加工产品均是其他家畜无法替代；
但高原气候条件恶劣，冬季缺乏饲草料，导致牦牛营养不良及个体生产性能下降，严重制约着牦牛产业的可持续发展。低温环境所引起的冷应激，会导致牦牛抵抗能力降低及采食量下降，甚至致使怀孕牦牛流产等（贾银海等，2021）。因此，揭示牦牛抗冷适应能力的作
用机理，对保护牦牛品种资源及促进牦牛产业的可持续发展具有重要意义。【前人研究进展】动物在受到冷应激时，其机体通过增加产热以维持体温恒定。在冷应激条件下，肌体会产生一系列变化，通过震颤或非震颤产热（郝力仕，2019）。冷应激不仅影响动物的生产性能，还会对动物的免疫能力及抗氧化能力等造成不同程度的影响（郭爽等，2021；贾银海等，2021）。决定动物抗寒性的因素诸多，包括皮肤表面积、产热性能、蒸发损耗、代谢损耗、脂肪厚度、皮肤厚度、体毛长度和细度及环境湿度等，许多动物在低温条件下可合成重结晶抑制效应的抗冻蛋白，降低体内的体液冰点，从而最大限度地保持体液的液体状态（de Maayer et al.，2014）。至今，有关抗冻蛋白（Antifreeze protein，AFP）的研究主要集中在鱼类
TMT proteomics and bioinformatics to analyze differential
proteins in cold resistance of yaks
JIA Yin-hai1，ZHANG Cheng-fu2，ZHANG Qiang2，JI Qiu-mei2，HUANG Guang-yun1，JIANG Hui2，WEN Xin-wang1，HUANG Ming-guang1，PENG Xia-yun1，WU Zhu-yue1（1Animal Husba
ndry Rearch Institute of Guangxi/Guangxi Key Laboratory of Livestock Genetic Improvement，Nanning530001，China；2Institute of Animal Science and Veterinary，Tibet Academy of Agricultural and Animal Husbandry Sciences/State Key Laboratory of Hulless Barley and Yak Germplasm Resources and
Genetic Improvement，Lhasa850000，China）
Abstract：【Objective】To elucidate the mechanism of cold resistance of yak from protein level，and to further im-prove its metabolic performance from the perspective of nutrition，so as to provide scientific basis for yak to effectively re-sist harsh climate conditions.【Method】The yak antifreeze proteins were extracted by TMT proteomics in cold ason （January）and warm ason（August），and the subcellular localization analysis，domain analysis，GO functional analysis，KEGG signaling pathway annotation analysis，protein interaction were analyzed.【Result】A total of21856peptides were identified，of which18452were specific peptides and4519proteins were identified.There were144subcellular proteins，including89up-regulated proteins and55down-regulated proteins.144yak antifreeze differential proteins were subcellu-lar mapped to7items，including56nuclear proteins，51cytoplasmic proteins，24plasma membrane proteins，23extra-cellular proteins，18mitochondrial proteins，1cytoskeleton protein and1lysosomal protein.A total of1
94domains were identified.GO enrichment of function analysis indicated that，biological process mainly enriched to cell protein79，70 metabolic process protein and42regulation protein，molecular function mainly enriched to combine functional protein75 and64catalytic activity of the protein，cell component part mainly enriched to the89cell protein and89cell proteins.The 144yak antifreeze differential proteins were annotated into205KEGG signaling pathways in KEGG databa，which mainly involved in ribosomes，nitrogen metabolism，cytoplasmic DNA nsing，in vivo thermogenesis，oxidative phos-phorylation，interleukin-17and calcium ion signaling.It was found that L8IHE5had the highest correlation，and cold-in-duced RNA-binding proteins（CIRP）and HSP70binding protein had more interaction in the network.【Conclusion】Ac-cording to TMT proteomics，144differential antifreeze proteins（89up-regulated proteins and55down-regulated pro-teins）are identified，among which CIRP and HSP70are up-regulated under cold stress，which can promote yak body to adapt to low temperature environment，and can be ud as candidate molecular markers for yak antifreeze breeding.
Key words：yak；TMT proteomics；bioinformatics；cold resistance；differential proteins
Foundation items：Guangxi Science and Technology Major Special Project（Guike AA17204028）；Tibet Academy of Agricultural and Animal Husbandry Sciences/State Key Laborator
y of Hulless Barley and Yak Germplasm Resources and Genetic Improvement Open-project（XZNKY-2020-C-007K05）
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（Inglis et al.，2006；Gamham et al.，2008）、昆虫（Meister et al.，2015）、植物（Ji et al.，2017；Sperotto et al.，2018）及菌类（Muñoz et al.，2017）等物种上，其中又以鱼类的研究最深入（钟其旺和樊廷俊，2002；Martínez-Páramo et al.，2009；Duman，2015）。Kim等（2019）对南极鱼亚目物种基因组中的高度保守核苷酸片段（Conrved nucleotide elements，CNEs）进化模式进行分析，结果发现南极鱼类对血红细胞发生过程的调控是适应低温的一个重要机制；Daane 等（2020）研究表明，在长期的低温环境下CNEs存在快速突变功能丢失的趋势；Ren等（2021）从基因层面开展研究，发现通路MAPK在鱼类低温应激中占据重要位置，且可能与其他重要的通路如TGF-Bata等存在复杂联系。在高寒地区，植物在面对低温环境也会产生抗寒机制的产物，但其含量远低于鱼类的抗冻蛋白（Ji et al.，2017）。在大部分昆虫体内都存在抗冻蛋白，其含量较鱼类抗冻蛋白高10~100倍，且其蛋白结构存在明显差异（Meister et al.，2015）。此外，有研究已将抗冻蛋白添加至化妆品中，通过皮肤吸收能起到保护皮肤、防止皮肤冻伤的作用，即可用于高级防冻化妆品（Evans and Fletcher，2004；巩子路，2015）。可见，抗冻蛋白对于不同物种发挥抗冷性能均有重要意义。【本研究切入点】不同物种为适应外界环境条件的变化，通常会产生应对环境条件变化的相关产物，
目前国内外针对抗冻蛋白已有深入研究（钟其旺和樊廷俊，2002；Martínez-Páramo et al.，2009；Duman，2015），但有关我国牦牛抗逆性及其抗冻蛋白方面的研究鲜见报道。【拟解决的关键问题】基于TMT（Tandem mass tag）蛋白组学及生物信息学分析对牦牛抗冻蛋白进行筛选研究，旨在阐明牦牛抗寒性能机理，并进一步从营养学角度提高其代谢性能，为牦牛有效抵御外界恶劣气候条件提供科学依据。
1材料与方法
1.1试验材料
供试牦牛由西藏农牧科学院畜牧兽医研究所改则县古姆乡和斯布牦牛养殖基地提供，分别于气候寒冷的冬春季（1月）和气候温和的夏季（8月）采集6~8岁经产牦牛耳组织样品，各8头，-80℃低温保存备用。TMT分子标记试剂盒购自美国ThermoFisher 公司，BCA试剂盒购自南京诺威赞生物科技股份有限公司，乙腈和超纯水购自Fisher Chemical公司，SDS、三氟乙酸、碘代乙酰胺、二硫苏糖醇（DTT）、尿素及四乙基溴化铵等试剂购自Sigma公司。1.2蛋白提取和肽段酶解
分别设寒冷季节组和温暖季节组，其中，寒冷季节组3个重复（CON-1、CON-2和CON-3），温暖季节组3个重复（T-1、T-2和T-3）。采用SDT裂解法（4% SDS，100mmol/L Tris/HCl，0.1mol/L DTT，pH7.6）提取蛋白，取适量蛋白使用FASP（Filter aided pro-teome preparation）进行胰蛋白酶酶解（
Wiśniewski et al.，2009），并以C18Cartridge对肽段进行脱盐；冻干后的肽段加入40μL0.1%甲酸溶液复溶，应用TMT标记不同样品中的同一蛋白，再以BCA法进行定量分析（贾银海，2018）。
1.3TMT分子标记
取100μg肽段按TMT分子标记试剂盒说明分别对各样品进行标记（葛泽勇，2018）。RP（反相）分级：采用High pH Reverd-Pha Peptide Fractiona-tion Kit对TMT标记的每组肽段等量混合后进行分级（葛泽勇，2018）。以乙腈和0.1%三氟乙酸（TFA）进行色谱柱平衡，将TMT标记肽段混合样品上样，低速离心脱盐，然后依次用不同梯度浓度的高pH乙腈溶液对结合肽段进行梯度洗脱。真空干燥后，以12μL0.1%脂肪酸（FA）进行复溶，于280nm处测定肽段浓度。阳离子交换柱（SCX）分级：采用AKTA Purifier100对TMT标记的每组肽段混合后进行分级（葛泽勇，2018）。缓冲液A液［10mmol/L KH2PO4，25%乙腈，pH3.0］，B液（10mmol/L KH2PO4，500 mmol/L KCl，25%乙腈，pH3.0）。A液平衡色谱柱，以1mL/min的流速经色谱柱进行分离。B液梯度如下：0%，25min；0%~10%，25~32min；10%~20%，32~ 42min；20%~45%，42~47min；45%~100%，47~52 min；100%，52~60min；60min后B液重设为0%（蒋少秋，2020）。洗脱过程监测214nm处的吸光值（OD214），每隔1min收集1次洗脱组分，冻干后采用C18Cartridge进行脱盐（蒋少秋，2020）。
1.4LC-MS/MS数据采集
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采用纳升流速的HPLC液相系统Easy nLC对每份样品进行分离（张弛，2020）。缓冲液A液为0.1%甲酸水溶液，B液为0.1%甲酸乙腈水溶液（乙腈为84%）。95%的A液平衡色谱柱，样品通过进样器上样至C18反相分析柱（Thermo Scientific Acclaim Pep-Map100，100μm×2cm，nanoViper C18），采用B液线性梯度分离，以300nL/min的流速流经分析柱（Ther-mo Scientific EASY column，10cm，ID75μm，3μm，C18-A2），再用Q-Exactive质谱仪进行质谱分析，并采集数据（杨重晖，2020）。
贾银海等：基于TMT蛋白组学及生物信息学分析牦牛抗冻差异蛋白
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南方农业学报
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1.5蛋白鉴定及定量分析
采用Mascot2.2和Proteome Discoverer1.4对质谱分析原始数据进行鉴定及定量分析（贾银海，2018）。
1.6生物信息学分析
1.6.1亚细胞定位分析采用CELLO（cello. u.edu.tw/）进行亚细胞定位预测，即以多重支持向量机（multi-class SVM）的机器学习方法对公共数据库中已知亚细胞定位信息的蛋白序列数据进行建模，预测待检索蛋白亚细胞定位情况。
1.6.2蛋白结构域分析使用Pfam数据库的Inter-ProScan数据包，采用运行扫描算法对蛋白序列进行功能表征预测，以获得目标蛋白序列在Pfam数据库中的结构域注释信息。
银谷美泉1.6.3GO功能富集分析利用Blast2GO对目标蛋白集合进行GO功能富集分析，具体分析过程可归纳为序列比对（BLAST）、GO条目提取（Mapping）、GO 注释（Annotation）及InterProScan补充注释（Annota-tion augmentation）等（贾银海，2018）。
1.6.4KEGG信号通路注释分析利用KAAS（KEGG automatic annotation rver）对目标蛋白集合进行KEGG信号通路注释分析（贾银海，2018）。
1.6.5蛋白相互作用网络分析依据IntAct（ www.ebi.ac.uk/intact/main.xhtml）或STRING（ /）数据库分析蛋白间的连接数，预测蛋白与蛋白间的相互作用关系，同时以CytoScape 3.
2.1绘制蛋白相互作用网络结构图并进行分析（贾银海，2018）。
1.6.6蛋白层次聚类分析首先对目标蛋白集合的定量信息进行归一化处理，即归一化至（-1，1）区间；使用ComplexHeatmap Version3.4从抗冻差异蛋白样本及其表达量2个维度进行分类，并生成层次聚类热图（杨重晖，2020）。
2结果与分析
2.1牦牛抗冻蛋白鉴定结果
由图1和图2可知，经Mascot2.2鉴定和Pro-teome Discoverer1.4定量分析共获得433236张总谱图（Total spectra）。其中蛋白谱图（Spectra）45950张；肽段（Peptide）数量为21856个，其中特有肽段（Unique peptide）数量为18452个；蛋白（Protein）数量为4527个，定量到的蛋白数量为4519个。对牦牛抗冻差异蛋白进行筛选，结果筛选获得144个差异蛋白，其中上调蛋白89个、下调蛋白55个。2.2亚细胞定位预测结果
CELLO亚细胞定位预测结果表明，144个牦牛抗冻差异蛋白定位到7个条目上（图3），分别是细胞核（Nuclear）蛋白56个、细胞质（Cytoplasmic）蛋白51个、质膜（Plasma membrane）蛋白24个、细胞外（Ex-tracellular）蛋白23个、线粒体（Mitochondrial）蛋白18个及其他蛋白2个［细胞骨架（Cytoskeleton）蛋白1个和溶酶体（Lysosome）蛋白1个］。
2.3蛋白结构域分析结果
通过评价鉴定获得蛋白在某个结构域条目下图1牦牛蛋白鉴定信息统计结果
Fig.1The information statistics of protein identification in yak 图2牦牛抗冻差异蛋白定量分析结果
Fig.2Quantitative result of differential protein in cold resis-tance of yak
图3牦牛抗冻差异蛋白亚细胞定位分析结果
Fig.3Subcellular localization analysis of differential protein in cold resistance of
yak
Plasma membrane，24Extracellular，23
Mitochondrial，18 Cytoplasmic，51
马上停车Others，2
打台球Nuclear，56
1期
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汪逸
的富集水平及对应的差异蛋白，对牦牛抗冻差异蛋白进行结构域分析，共鉴定到194个结构域，排名前20位的结构域分析结果如图4所示。其中，Uteroglo-bin family （子宫珠蛋白家族）、Copper/zinc supero-xide dismuta （SODC ）（铜/锌超氧化物歧化酶）、Zn-finger in Ran binding protein and others （含锌指Ran 结合结构域蛋白）及Acetyltransfera （GANT ）family （C-酰胺化酶家族）是机体参与抗冻应答的相关蛋白。2.4GO 功能富集分析结果
对牦牛抗冻差异蛋白进行GO 功能富集分析，结果（图5）显示，生物过程（Biological process ）主要富集到细胞过程（Cellular process ）蛋白79个、代谢过程（Metabolic process ）蛋白70个和生物调控（Biologi-cal regulation ）蛋白42个等，分子功能（Molecular function ）主要富集到结合功能（Binding ）蛋白75个和催化活性（Catalytic activity ）蛋白64个等，细胞组分（Cellular component ）主要富集到细胞部分（Cell part ）蛋白89个和细胞（cell ）蛋白89个等。在生物过程中，Cellular carbohydrate metabolic process （细胞
碳水化合物代谢过程）上调，而Energy rerve meta-bolic process （能量储备代谢过程）、Oxidation-reduc-tion process （氧化还原反应过程）、Cellular glucan metabolic process （细胞糖代谢过程）、Regulation of gluco metabolic process （细胞糖代谢调控过程）及Cellular carbohydrate catabolic process （细胞碳水化合物分解代谢过程）等条目下调；在分子功能中，Ox-idoreducta activity （氧化还原酶活性）上调，而Anti-oxidant activity （抗氧化活性）、Transamina
activity （转氨酶活性）及Catalytic activity （催化活性）等条目下调；在细胞组分中，Integral component of mem-brane （膜的整体组分）及Intrinsic component of mem-brane （膜的内在成分）等条目上调，而Mitochondrial outer membrane （线粒体外膜）、Postsynap （突触后膜）、Nuclear outer membrane-endoplasmic reticulum membrane network （核外膜—内质网膜网络）等条目下调。
图4牦牛抗冻差异蛋白结构域分析结果
Fig.4
Protein domain analysis of differential protein in cold resistance of yak
结构域名称（T o p 20）D o m a i n n a m e
富集程度Enrichment level
贾银海等：基于TMT 蛋白组学及生物信息学分析牦牛抗冻差异蛋白
