第57卷 第6期 土 壤 学 报 Vol. 57，No. 6
2020年11月
ACTA PEDOLOGICA SINICA Nov.，2020
* 国家自然科学基金项目（41877041）和山东省泰山学者青年专家经费（tsqn201812086）资助Supported by the National Natural Science Foundation of China （No. 41877041）and the Taishan Scholars Program of Shandong ，China （No. tsqn201812086） † 通讯作者Corresponding author ，E-mail ：作者简介：李金业（1996—），男，硕士，主要研究领域是黄河三角洲滨海湿地甲烷厌氧氧化过程。E-mail ：收稿日期：2019–10–29；收到修改稿日期：2020–01–04；网络首发日期（ ）
：2020–03–12 DOI ：10.11766/trxb201910290500
李金业，陈庆锋，尹志超，冯优，庄新军，张庆丽. 湿地甲烷厌氧氧化机制研究进展[J]. 土壤学报，2020，57（6）：1353–1364. LI Jinye ，CHEN Qingfeng ，YIN Zhichao ，FENG You ，ZHUANG Xinjun ，ZHANG Qingli. A Review of Rearches on Anaerobic Oxidation of Methane (AOM ) in Wetlands [J]. Acta Pedologica Sinica ，2020，57（6）：1353–1364.
血糖仪的使用方法
湿地甲烷厌氧氧化机制研究进展*
李金业1，陈庆锋1†，尹志超2，冯 优1，庄新军3，张庆丽3
带枪的人打一城市名字（1. 齐鲁工业大学（山东省科学院），山东省分析测试中心，济南 250014；2. 济南大学土木建筑学院，济南 250022；3. 许家崖水库管理处，山东临沂 273400）
摘 要：微生物主导的甲烷厌氧氧化（AOM ）一直是甲烷（CH 4）氧化研究的前沿热点问题，对控制全球湿地CH 4排放具有重要意义。介绍了硫酸盐还原型（SAMO ）、反硝化型（DAMO ）、金属氧化物驱动型（Metal-AOM ）和中间电子直接转移
型（DIET ）四种AOM 途径，其中，SAMO 以24SO -作为AOM 的最终电子受体，DAMO 以 2NO -/3NO -我的青春色彩
作为AOM 的最终
电子受体，Metal-AOM 以铁锰等金属离子/金属氧化物作AOM 的最终电子受体，而种间电子转移是一种不需要中间产物的转移方式。详细阐述了途径中主要功能微生物菌群的相关研究，重点讨论了AOM 途径中可能发生的反应机理和进展，论述了目前常用的微生物群落结构和丰度检测分析的分子生物学方法。最后，从湿地环境因子对参与AOM 微生物的影响机制、功能微生物富集培养以及湿地微生物
参与环境污染控制等方面进行展望。这对于进一步研究全球湿地碳、氮循环提供了微生物学方面的参考。
关键词：甲烷厌氧氧化；湿地；功能微生物菌群；分子生物学方法；碳循环 中图分类号：X172 文献标志码：A
A Review of Rearches on Anaerobic Oxidation of Methane (AOM) in Wetlands
LI Jinye 1, CHEN Qingfeng 1†, YIN Zhichao 2, FENG You 1, ZHUANG Xinjun 3, ZHANG Qingli 3
(1. Shandong Analysis and Test Center , QiLu University of Technology (Shandong Academy of Science ), Jinan 250014, China ; 2. School of Civil Engineering and Architecture , University of Jinan , Jinan 250022, China ; 3. Xujiaya Rervoir Management Office , LinYi , Shandong 273400, China )
Abstract: Microbe-dominated anaerobic oxidation of methane (AOM) is a pathway of methane (CH 4) oxidation that has long
been a frontier rearch hot spot of great significance for controlling CH 4 emission in global wetlands. This paper introduces four AOM pathways, including Sulphate-dependent anaerobic methane oxidation (SAMO), Denitrification-dependent anaerobic methane oxidation (DAMO), Metal
oxide driven anaerobic methane oxidation (Metal-AOM) and direct intermediate electron
transfer type of anaerobic methane oxidation (DIET). Among them, SAMO takes 24SO -
as the final electron acceptor of AOM,
1354 土 壤 学 报 57卷while DAMO does 2
NO-/3
NO- and Metal-AOM does iron/mangane metal ions/oxides, but DIET does not require any intermediate products. Besides, the review elaborates in detial relevant rearches on main functional microbial groups, discuss potential reaction mechanisms and process that may occur in AOM, elaborates molecular biology methods commonly ud to analyze and determine structures and abundances of microbical communities, and prents a list of marker genes of veral major functional microbial groups. At the end, the paper describes prospects of the rearches on mechanisms of wetland environmental factors affecting AOM microbes, enrichment culturing of functional microbes and wetland soil microbes participating in controlling environmental pollution. This paper may provide certain a microbiological reference for further rearches on carbon and nitrogen recycling in global wetlands.
Key words: Anaerobic oxidation of methane (AOM); Wetland; Functional microbial flora; Molecular biology method; Carbon recycling
中国一直积极参与国际气候变化治理及全球减排进程，在《巴黎协定》上提出我国碳减排目标：2020年碳排放强度相比2005年降低40%～45%，2030年碳排放强度相比2005年下降60%～65%[1]。因此，我们要积极采取措施加快碳减排进程，大力减少碳排放总量。湿地是大气中CH4最大的天然排放源[2]。近年来，CH4浓度以每年约6×10–3cm3 m–3的速度剧烈上升[3]，2018年1—10月全球平均温度较工业化前高0.98±0.1℃，是有记录以来第四最温暖的年份，仅次于发生了超级厄尔尼诺的2015年、2016年和2017年，CH4浓度达到了 1 859（±10）×10–3cm3 m–3，是工业化前水平的257%[4]。创纪录的温室气体浓度将全球温度推向越来越危险的水平，不仅影响到全球气候变化，而且气候变化的反馈作用会破坏生态系统的稳定性，从而进一步推动变暖。
CH4的氧化分为两大类型（图1）：一类是有氧条件下由微生物利用O2作为电子受体将CH4氧化；另一类是在厌氧条件下由微生物利用除O2外的其他电子受体（如3土旁的字有哪些
NO-等）将CH4氧化[5]。长期以来，人们一直认为CH4的有氧氧化是CH4氧化的唯一过程。然而，直到1974年开始，有研究者[6]在厌氧海洋沉积物中发现硫酸盐还原对CH4的厌氧氧化，从而改变了一直以来对CH4仅存在好氧氧化的认识。以往研究表明，甲烷厌氧氧化（AOM）大约消耗了海洋CH4排放
通量的90%以上[7]，减少了淡水湿地CH4排放通量的50%以上[8]，从而降低了大气中CH4的浓度水平。由于湿地受周期性淹水的影响，湿地土壤呈现间歇性的淹水状态，具有好氧、厌氧界面，
注：ANME，甲烷厌氧氧化古菌。 Note：ANME，Anaerobic methanotrophic archaea.
图1 CH4氧化原理[5]
Fig. 1Methane oxidation principle[5]
6期 李金业等：湿地甲烷厌氧氧化机制研究进展 1355
同时土壤中含有丰富的有机质和各种电子受体，有机质分解后会产生大量CH 4，具备了发生AOM 的良好条件。近年来，微生物技术与方法的发展促进了学者们对微生物世界的探索，特别是稳定同位素标记法、高通量测序、变形梯度凝胶电泳（DGGE ）、宏基因组学和单细胞水平研究方法（如纳米二次离子质谱与荧光原位杂交相结合的方法）[9-11] 等技术的应用，为研究者进行环境微生物的研究提供了技术手段，掀起了国际上对AOM 研究的高潮，一些标志性成果相继发表在国际学术刊物Science 和Nature 上。因此，有关湿地CH 4的生物地球化学循环研究一直是国际前沿与热点。
1 AOM 途径的研究进展
目前，根据电子受体的不同，AOM 途径主要为硫酸盐还原型甲烷厌氧氧化（SAMO ），反硝化型甲烷厌氧氧化（DAMO ），以Fe 3+、Mn 4+作为电子受体的甲烷厌氧氧化（Metal-AOM ）以及种间直接电
子转移（DIET ）。
1.1 硫酸盐还原型甲烷厌氧氧化（SAMO ）
SAMO 过程的微生物包含甲烷厌氧氧化古菌（ANME ）和硫酸盐还原细菌（SRB ）。这两类微生物在空间上紧密耦合联系[12]，通常以聚集体的形式存在[13]。研究者们基于16S rRNA 和改良胞嘧啶限制蛋白A （mcrA ）基因多态性，将ANME 划分为3类：ANME-1、ANME-2、ANME-3，均属于广古菌门，它们的亲缘关系如图2a ）[14]：ANME-1与产甲烷微菌目（Methanomicrobiale ）有较远的亲缘关系；ANME-2属于产甲烷八叠球菌目（Methanosarcinales ），包含4个亚簇：ANME-2a 、ANME-2b 、ANME-2c 、ANME-2d （又叫AAA ）；而ANME-3与甲烷拟球菌属（Methanococcoides ）亲缘关系较近。这3类ANME 的序列相似度仅有75%～92%，但生理特性相似，表明不同的ANME 群落偏好不同的生态环境。ANME- mcrA 基因的系统发育分析显示，ANME-1—3的亲缘关系十分疏远（图2b ）），与16S rRNA 结果相符合。
图2 ANME 系统发育树[14]
Fig. 2 Phylogenetic trees of ANME [14]
SRB 种类丰富，在SAMO 过程中主要包括脱硫八叠球菌属（Desulfosarcina ）、脱硫球菌属（Desulfococcus ）和脱硫叶菌属（Desulfobuibus ）。脱硫八叠球菌属（Desulfosarcina ：DSS ）
和脱硫球菌属（Desulfococcus ）主要吸附在ANME-1、ANME-2上，形成细胞絮凝体[15-16]；脱硫叶菌属一般与ANME-3共存发生作用（图3a ））。ANME-2
与SRB 组成互养共生体，其内部核心由ANME-2充当，而其外部被SRB 构成的壳层部分或全部包围（图3b ），图3c ））[17]。随着进一步的研究发现，SRB 与ANME 的共存形式呈现多样化，如在Eel 河流域沉积物中发现了脱硫叶菌属与ANME-2c 共存现象，以及脱硫八叠球菌属和脱硫球菌属与ANME-2c 共存的现象[18]；更多的证据表明与
1356 土 壤 学 报 57卷
ANME 共生的细菌可能不仅限于SRB ，而是具有较高的多样性[19]，如仅由ANME-2细胞形成的单一类型微生物的共生体（图3d ））[20-21] ；在某些
环境发现α-变形菌纲的Spbingomonas spp.和β-变形菌纲的 Burkbolderia spp.也会与ANME-2c 关联生长[18]。
图3 通过荧光原位杂交（FISH ）显示的不同类型甲烷厌氧氧化（AOM ）古菌团聚体的荧光显微照片（a ）ANME-3（红色）与脱硫叶菌（绿色）团聚体；b ）渗漏沉积物中观察到ANME-2a （红色）和脱硫八叠球菌属（DSS ）
（绿色）细胞的混合型聚生体；c ）渗漏沉积物中的ANME-2c （红色）和DSS （绿色）细胞的壳型聚生体；d ）渗漏沉积物中单个ANME-2c
细胞[14] .）
Fig. 3 Epifluorescence micrographs of different species of anaerobic methanotrophic archaea （ANME ）aggregates visualized by fluorescence in situ hybridization （FISH ）（a ）ANME-3（red ）and Desulfobulbus （green ）consortia ；b ）Mixed-type consortia of ANME-2a （red ）and Desulfosarcina （DSS ）（green ）cellso brved in diments ；c ）Shell-type consortia of ANME-2c （red ）and DSS （green ）cells in diments ；
d ）singl
e ANME-2c cells obrved in diments [14].）
当前，SAMO 理论反应机理主要有四种（表1）：反向产甲烷理论、乙酸生成理论、甲基化理论和以
S 0作为中间产物（图4）的SAMO 机理[28-39]。其中，反向产甲烷理论模型研究得最深入[28-34]。
表1 硫酸盐还原型甲烷厌氧氧化四种理论模型
Table 1 Introduction of four theoretical models of sulfate reducing anaerobic oxidation of methane （SAMO ）
理论模型 Theoretical model 反应原理 Reaction principle
化学方程式 Chemical equation
菌群Flora
文献Reference
反向产甲烷理论
H 2O 得到CH 4氧化所释放的电子后还原为 H 2（式（1）），而H 2被SRB 所利用（式（2））
道路标识图案大全CH 4 + 2H 2O →CO 2 + 4H 2（1）
24SO -
麻料鸟
+ 4H 2 +H + →HS –+4H 2O （2） ANME
SRB [22-24]
乙酸生成理论
第一种：ANME 将CH 4氧化并产生H 2和乙酸
产物，乙酸为SRB 提供了碳源将24SO -
还原为
HS −（式（3））
第二种：ANME 利用CO 2将CH 4氧化为乙酸
（式（4）），SRB 利用乙酸生成3HCO -
和HS −
（式（5））
2CH 4 +24SO - →
2HCO –+HS –+2H 2 （3）
CH 4+3HCO -
→CH 3COO –+H 2O （4） CH 3COO –+24SO -→3HCO -+HS
– （5）
ANME SRB
[23，25]
甲基化理论 ANME 通过CH 4氧化和 CO 2还原产生甲基硫
（CH 3S –）（式（6）），CH 3S –最终被SRB 利用生成
3
HCO -
和HS –
（式（7））
3CH 4+3
HCO -
+5H ++4HS –→H 3CSH +3H 2O （6）
4H 3CSH + 324SO -
→ 43
HCO -
+7HS –+5H +（7） ANME
SRB
[26-27]
以S 0作为中间 产物
ANME 氧化CH 4生成 CO 2过程中产生的电子
被用于24SO -
的还原，在细胞内生成中间产物
S 0并排出胞外与硫化物反应形成二硫化物
歧化反应（图4）
ANME-2 [28-29]
注：SRB ：硫酸盐还原细菌。Note ：SRB ：Sulfate reducing bacteria.
安身立命的意思6期李金业等：湿地甲烷厌氧氧化机制研究进展 1357
图4 以S0作为中间产物的甲烷厌氧氧化 [28]
Fig. 4 Anaerobic oxidation of methane with S0 as the intermediate
8月生日product28]
乙酸生成理论是对反向产甲烷理论的补充与发展，它解释了H2在 AOM 过程中并非起中间体作用，H2浓度与AOM作用之间的影响关系。以S单质作为中间产物的SAMO机制被认作是一个全新的途径[30]，该过程由ANME的一个分支（ANME-2）在无SRB参与下，以S0为中间载体完成了AOM过程中的硫酸盐还原，从一个全新的角度定义ANME 和SRB的功能，开拓了一个新的研究方向。
1.2反硝化型甲烷厌氧氧化（DAMO）
参与DAMO途径的微生物是一类新的微生物Candidatus Methylomirabilis oxyfera（M. oxyfera）[17]，隶属于新发现的细菌门—NC10 门，且所有与反硝化过程耦合的AOM富集培养中均含有一定量（30%～80%）的NC10门细菌；其他少数古菌为ANME（属于甲烷八叠球菌目）的AAA分支的细菌。NC10门细菌细胞呈细杆状、杆状，以单细胞或团聚体的形式存在。根据NC10门设计的特异引物，将基因库中的序列比对之后发现，NC10门细菌包括a、b、c及d四个类群。然而，目前所富集的细菌均归属于a类群，说明a类群是参与DAMO的主要功能群，而NC10门中其他种类的细菌是否具有甲烷厌氧氧化的能力尚未确定。
目前针对DAMO机理的研究分为NC10门细菌单独催化 DAMO 的催化机理和古菌协同催化机理两个研究方向（图5）[31]。
（1）NC10门细菌催化DAMO机理 2006年，Raghoebarsing等[32]通过全基因测序推测出DAMO 的机理：基于M. oxyfera本身缺少编码NO还原酶的基因却能够自己生成O2的实验结果，推测它的细
胞内存在某种能够歧化NO生成O2的未知酶，将产生的一部分（3/4）O2用于CH4的氧化反应；2011年Wu等[33]提出了M. oxyfera细菌的分解代谢和能量代谢途径：在亚硝酸还原酶的作用下，2
NO-还原生成的 NO经过NO歧化酶分解成N2和O2，产生的O2用于CH4氧化，依次在甲烷单加氧酶（MMO）、甲醇脱氢酶（MDH）、甲醛脱氢酶（FADH）和甲酸脱氢酶（FDH）的作用下最终被氧化成 CO2和H2O；2012年Wu等[34]通过免疫学标记实验，进一步发现M. oxyfera细菌中存在CH4氧化的关键酶（甲烷单加氧酶）（pMMO）和反硝化过程的关键酶2
NO-还原酶（NirS），验证了Raghoebarsing[32]提出的NC10门细菌独自完成甲烷厌氧氧化耦合亚硝酸盐还原过程。
（2）古菌参与DAMO的催化机理目前，对于古菌参与DAMO途径的研究较少。在Raghoebarsing[32]、Hu等[35]的文章中提到DAMO 的富集培养物中存在着古菌和细菌的混合物，且均具有消耗3
NO-或2
NO-的能力，他们推测古菌催化3
NO-的能力要强于NC10门细菌，而NC10细菌对2
NO-的竞争能力则强于古菌，古菌将3
NO-转化为2
NO-，为后续的AOM提供反应物，即3
NO-是古菌的电子受体，2
NO-为细菌的电子受体。后来Haroon等[31]证实古菌ANME-2d能够利用3
NO-作为最终电子受体独自实现整个AOM过程。
图5 2
NO-/3
NO-型AOM途径[31]
Fig. 5Anaerobic oxidation of methane（AOM）coupled with
2
NO-/3
NO-reduction[31]
DAMO的研究进展如表2所示，这是一种近年新发现的AOM途径，在微生物学、生态学和环境工程领域有很大的研究价值和前景，发现至今受到众多学者的关注。研究者致力于分析 DAMO 功能微生物、功能微生物的内在机理及其富集的影响因素和
