生态毒理学报
Asian Journal of Ecotoxicology
第16卷第5期2021年10月
V ol.16,No.5Oct.2021
㊀㊀基金项目：国家重点研发计划资助项目(2016YFC0401108)；国家自然科学基金资助项目(21777020)；中央高校基本科研业务费(DUT20LK19)㊀㊀第一作者：宋京洋(1996 )，女，硕士研究生，研究方向为环境毒理学,E -mail:**********************. ㊀㊀*通讯作者(Corresponding author ),E -mail:****************
DOI:10.7524/AJE.1673-5897.20210406002
宋京洋，李泽昌，杨婧，等.代表性二级处理㊁三级处理和湿地生态修复技术对城镇污水人源干细胞毒性的削减[J].生态毒理学报,2021,16(5):79-86
Song J Y ,Li Z C,Yang J,et al.Reduction of cytotoxicity in human stem cells by reprentative condary urban wage treatment,tertiary treatment and wetland ecological restoration technology [J].Asian Journal of Ecotoxicology,2021,16(5):79-86(in Chine)
代表性二级处理㊁三级处理和湿地生态修复技术对城镇污水人源干细胞毒性的削减
宋京洋，李泽昌，杨婧，王思予，池勾剑，崔源源，赵静，刘薇*
大连理工大学环境学院，工业生态与环境工程教育部重点实验室，大连116024收稿日期:2021-04-06㊀㊀录用日期:2021-05-29
摘要：污水中的难降解污染物往往具有浓度低但毒性强的特点，可以通过多种暴露途径直接或间接对人体健康产生有害影响，因此有必要评估污水处理技术对健康效应的削减效果㊂本研究选择人骨髓间充质干细胞(human bone marrow menchy -mal stem cells,hBMSCs)体外模型，评估典型二级处理㊁三级处理和湿地修复技术进水㊁主要工艺排水的综合毒性，并与发光菌急性毒性测试结果进行比较㊂水样萃取物对hBMSCs 的细胞毒性呈剂量依赖性关系，进水毒性单位(toxicity unit,TU)在0.03~0.22范围内，出水TU 为0.02~0.03㊂二级处理技术对细胞毒性的削减率为59.8%㊂三级处理过程中经混凝㊁微滤和反渗透
处理后，出水无显著细胞毒性，但经臭氧消毒后最终排水的细胞毒性较进水无显著变化㊂湿地修复技术对细胞毒性的削减率
为49.9%㊂66.7%(14/21)水样品对于hBMSCs 细胞毒性的TU 值高于发光菌急性毒性的TU 值㊂
在相对富集倍数(related fold
enrichment,REF)20%效应浓度(EC 20)下，二级处理和三级处理技术对污水hBMSCs 细胞毒性的削减
率低于发光菌急性毒性，但湿地修复技术对细胞毒性的削减率高于发光菌急性毒性㊂结果提示污水处理厂排水中残留的难降解有机污染物对人源干细胞具有较强的有害效应，为再生水水质安全性评价以及城镇污水资源化技术研发提供参考依据和方法㊂关键词：排水；人骨髓间充质干细胞；发光菌；综合毒性；毒性削减
文章编号:1673-5897(2021)5-079-08㊀㊀中图分类号:X171.5㊀㊀文献标识码:A
Reduction of Cytotoxicity in Human Stem Cells by Reprentative Second-ary Urban Sewage Treatment ,Tertiary Treatment and Wetland Ecologi-cal Restoration Technology
Song Jingyang,Li Zechang,Yang Jing,Wang Siyu,Chi Goujian,Cui Yuanyuan,Zhao Jing,
Liu Wei *
Key Laboratory of Industrial Ecology and Environmental Engineering of Ministry of Eduaction,School of Environment,Dalian Univer -sity of Technology,Dalian 116024,China
Received 6April 2021㊀㊀accepted 29May 2021
Abstract :The refractory pollutants in the wage wastewater usually exhibit high toxicity at low do,
which di -rectly or indirectly po harmful effects on human health via various exposure pathways.Therefore,it is necessary
. All Rights Rerved.
80㊀生态毒理学报第16卷
to evaluate the toxicity removal efficiency of different wage treatment technology.In this study,human bone mar-row menchymal stem cells(hBMSCs)was lected as an in vitro model to evaluate the integrated toxicity of the influent,the main unit process effluent from typical condary treatment,tertiary treatment and wetland ecological restoration technology,and the final effluent,in comparison with the commonly ud luminescent bacteria acute toxicity tests.The water extracts induced cytotoxicity in hBMSCs in a do-dependent manner.The influent toxicity unit(TU)was in the range of0.03~0.22,and the effluent TU from condary treatment was in the range of0.02
~0.03.The toxicity was reduced by59.8%after the condary treatment.After coagulation,microfiltration and re-ver osmosis in the tertiary treatment process,the effluent exhibited no significant cytotoxicity,but the cytotoxicity had no significant change after ozone disinfection.The cytotoxicity was reduced by49.9%after the wetland eco-logical restoration treatment.
The organic extracts in the wage caud higher toxicity to hBMSCs than lumines-cent bacteria.Compared with the test results of the acute toxicity in luminescent bacteria,66.7%(14/21)of the wa-ter samples showed higher toxicity to hBMSCs.Under20%effect concentration for related fold enrichment
(REFEC
20
),the reduction of cytotoxicity by condary and tertiary treatment technology was lower than the acute
toxicity of luminescent bacteria,but the reduction of wetland ecological restoration technology on the cytotoxicity
of wastewater was higher.The results suggested that the residual organic pollutants in the wastewater of wage
treatment plants had detrimental effects on human stem cells.Wetland ecological restoration technology may have
good prospects for reducing the cytotoxicity of wage.The results provided referential basis and methods for the
evaluation of the safety of reclaimed water quality and the development of urban wage recycling technology. Keywords:wastewater;human bone marrow menchymal stem cells(hBMSCs);luminescent bacteria;integrated toxicity;toxicity reduction
㊀㊀污水经处理后回用于农田灌溉㊁城市景观补给㊁洗车和工业用水，甚至被用于饮用水，是应对淡水资源稀缺的重要替代水源㊂目前，污水处理厂通常以传统的活性污泥和膜生物反应器等处理技术为基础，尽管处理后排水的理化参数满足当地或行业相应的排放标准，但仍残留低浓度有毒物质或形成毒性产物[1]㊂例如,Xue等[2]研究发现，现行的污水处理工艺(例如砂滤㊁混凝㊁活性炭吸附和消毒)对内毒素的处理效果较低，再生水的回用使内毒素的人体暴露水平升高㊂此外，某二级处理排水样品中检测到了遗传毒性作用，而进水并未检测出遗传毒性，可能在处理过程中形成了遗传毒物[3]㊂再生水中残留的有毒有害污染物可以通过多种暴露途径直接或间接对人体健康产生有害影响㊂因此，须对再生水回用进行综合毒性评估，有利于保障再生水回用的安全性[4]㊂欧美许多国家已开始推行毒性评估废水管理法律法规[5]㊂发光细菌㊁藻类和鱼类等水生生物毒性评估结果无法直接外推至人体健康，基于大鼠小鼠等哺乳动物实验仍存在种属差异的问题，同时受伦理学和周期成本等限制㊂
体外生物毒性测试在复合型污染特征下可敏感㊁准确地量化环境混合物的综合生物效应[6]，但目前仍较为缺乏面向人体健康的体外生物毒性模型㊂
本研究选择人骨髓间充质干细胞(hBMSCs)为体外
模型，评估典型二级处理㊁三级处理和湿地修复技术
生于忧患而死于安乐对污水综合毒性的削减㊂人源干细胞是一种前景良
好的体外毒理学模型，目前已应用于典型环境污染
物的毒性预测㊁评估和毒性机制解析，但在环境复合
污染毒性评估中的应用极为有限㊂笔者在前期研究
中，利用hBMSCs研究地表水的毒性特征，结果表
明基于hBMSCs的测试对水体复合污染在分子和
细胞水平造成的有害效应具有良好的灵敏性㊁重现自己生日配图
所思
性及人体健康相关性[7-8]㊂此外，本研究将基于人源干细胞的综合毒性评价结果与常用的发光菌急性毒
性测试进行比较㊂研究结果有助于更好地了解人源
干细胞对水体复合污染的毒性响应特征，为排水的
人体健康效应评估以及提升水处理技术的毒性削减
效能提供科学依据和参考方法㊂
1㊀材料与方法(Materials and methods)
1.1㊀样品采集及前处理
水样采自大连市㊁沈阳市和哈尔滨市的4个城
镇二级污水处理厂(A~D)㊁天津某再生水厂(E)和海
口市某湿地公园(F)㊂采集各厂进水㊁主要工艺出水
和最终出水，以超纯水作为流程空白㊂城镇二级污
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第5期宋京洋等：代表性二级处理㊁三级处理和湿地生态修复技术对城镇污水人源干细胞毒性的削减81
㊀水处理厂(A ~D)主要工艺均由活性污泥法和紫外消毒工艺组成，且进水主要来源为生活污水混有少量的工业废水㊂再生水厂(E)的进水主要来源为多个城镇二级污水处理厂排水，经混凝㊁微滤㊁反渗透和臭氧氧化三级处理工艺再次处理后排放回用㊂湿地公园(F)的进水主要为生活污水，预处理后经梯级潜流湿地和河流型湿地处理排放㊂A ~F 厂最终出水化学需氧量(COD)和氨氮均达到‘城镇污水处理厂污染物排放标准“一级A 标准，并回用于城市杂用水㊁景观用水和河道补给(图1)㊂
采集水样贮存在塑料桶中，立即运回实验室㊂用0.7μm(Waters,GF/B,47mm)玻璃纤维滤膜过滤水样后，在实验室进行COD 和氨氮理化参数的测定[9]㊂将水样进行富集浓缩，采用HLB(6mL,500mg,OASIS,Waters,USA)萃取柱萃取水中有机物，用二氯甲烷和甲醇进行洗脱，将洗脱液经氮吹后用
200μL 二甲基亚砜(DMSO)定容[10]㊂1.2㊀发光菌急性毒性实验
神一明亮发光杆菌T 3小种(Photobacterium phos -
phoreum T3spp )购自浙江清华长三角研究院(浙江,
中国)㊂将1mL 复苏液注入装有冻干粉的安瓿瓶
中，充分混匀㊂2min 后在暗室中可肉眼观察到菌
液发光，即复苏完成㊂采用3%NaCl(m ʒm )稀释浓缩菌液至合适浓度，作为后续测试菌液㊂实验采用3%NaCl 作为空白对照，并用3%NaCl 稀释水样㊂根据预实验已确定正式实验浓度范围，设定不同梯度浓度的水样作为实验组㊂明亮发光杆菌菌液与水样充分混匀15min 后，用原子摩尔冷光检测仪(Lu -min Max -C,Maxwell Sensors Inc)测定明亮发光杆菌的发光强度㊂每个实验组设置3个平行，重复实验结果的相对标准偏差(relative standard deviation,RSD)均<30%㊂发光菌的发光强度相对抑制率与各工艺出水急性毒性成正比，计算公式如下:
相对抑制率=
对照组发光强度-实验组发光强度
对照组发光强度
ˑ100%1.3㊀细胞毒性实验
人骨髓间充质干细胞(human bone marrow mes -
enchymal stem cells,hBMSCs)购自广州赛业公司(广州，中国)㊂培养条件控制为37ħ㊁5%CO 2和饱和湿度，细胞复苏㊁传代至6代进行实验㊂细胞生长至汇合度达到85%以上时，进行消化接板㊂含有0.1%DMSO(V ʒV )的培养基设为对照组，根据预实验已确定正式实验浓度范围，用含有0.1%DMSO
的培养基将水样萃取物稀释为不同的浓度梯度作为
图1 代表性城镇二级、三级污水处理厂和湿地修复技术处理流程和采样点分布
Fig.1㊀Treatment process and sampling points of reprentative urban condary and tertiary wage treatment
plants and wetland restoration technique
未字成语
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82㊀生态毒理学报第16卷
实验组㊂每个浓度设置3个平行，重复实验结果的RSD 均<30%㊂暴露48h 后吸出暴露液，加入配制的CCK -8工作液，设定仅含有CCK -8工作液的背景空白孔,37ħ孵育1.5~2h 后，用酶标仪(Spark,Tecan)450nm 波长下测量吸光度，并根据如下公式计算细胞毒性㊂
细胞毒性=(1-实验组吸光度-背景空白吸光度
对照组吸光度-背景空白吸光度
青稞米的功效与作用)ˑ100%
1.4㊀数据分析
根据浓度-效应关系计算水样萃取物对发光菌
和hBMSCs 产生毒性效应强度分别为20%和50%
的浓度即EC 20和EC 50㊂由于EC 20和EC 50的大小与急性毒性效应强弱呈反比，为更直观地评价2种模型的急性毒性，故采用1/EC 20和毒性单位(toxicity unit,TU)来进行比较㊂根据如下公式计算TU 值:
TU =1/EC 50
使用SPSS 16.0的单因素分析法进行数据显著性差异分析㊂
2㊀结果与讨论(Results and discussion )2.1㊀城镇二级㊁三级污水厂和湿地修复技术排水的发光菌急性毒性
㊀㊀尽管各个工艺水样在未经富集浓缩条件下(即稀释度100%)对发光菌没有产生显著的急性毒性㊂
巅峰见证进一步将水样富集浓缩后进行暴露，发光抑制效应呈明显的剂量依赖性(图2)㊂部分水样的有机萃取物
在稀释度100%(REF1)时对发光菌产生显著的急性毒性，主要原因可能为水样中的有机萃取物相对于水中的其他组分毒性更强㊂4个二级城镇污水处理厂中,A ㊁B 和C 最终排水的发光抑制效应较进水均有所减弱，经二级处理工艺后分别削减了88.9%㊁57.1%和66.7%㊂但其中经D 厂工艺处理后，发光菌的发光抑制作用显著增强了1倍㊂这说明尽管大部分二级处理可以有效去除水中毒性物质，但过程中潜在毒性副产物的生成也主要取决于不同的水质特点和处理的工艺条件㊂与本研究相似，某污水厂排水的生物发光抑制作用在物种敏感度分布模型(SSD)中都超过了影响5%水生生物的危险浓度(HC 5)的上限，对水生生物可能造成较高风险[11]㊂三级城镇污水处理厂(E)进水经混凝㊁微滤和反渗透处理后，对发光菌无明显毒性㊂但经臭氧消毒后，毒性较反渗透出水增强，但仍略低于进水㊂比较1/EC 20，再生水E 厂对于进水的发光菌急性毒性的削减率为66.8%㊂湿地公园(F)修复技术对进水的发光菌
急性毒性削减了45.6%㊂
2.2㊀城镇二级㊁三级污水厂和湿地修复技术排水对人源干细胞的细胞毒性
㊀㊀城镇二级㊁三级污水处理厂和湿地公园进水和各主要工艺出水对hBMSCs 产生的细胞毒性呈现明显的剂量-效应关系(图2)㊂4个二级城镇污水处理厂(A ~D)主要采用活性污泥法结合紫外消毒工艺，随着工艺的深入，细胞毒性显著降低㊂大连某污水处理厂A 的主要工艺特点为改良A 2O 工艺结合紫外消毒,A 厂各工艺出水的TU 分别为0.06㊁0.03和0.02，出水细胞毒性低于进水㊂大连某污水处理厂B 的
主要工艺为序批式活性污泥法(SBR)结合紫外消毒工艺㊂由B 厂各工艺出水的EC 50可计算得到进水和出水的TU 分别为0.11和0.03，细胞毒性总体削减率为35.0%㊂哈尔滨某污水处理厂C 对细胞毒性的削减率为40.0%㊂沈阳某污水处理厂D 进水和出水的TU 分别为0.05和0.02，细胞毒性削减率为60.0%㊂
天津某再生水厂E 的三级处理工艺，主要包括混凝㊁微滤结合反渗透及臭氧化消毒㊂经混凝处理后，污水细胞毒性没有显著变化，提示混凝对细胞毒物的削减能力较低㊂经微滤和反渗透单元处理后，污水的细胞毒性逐渐降低，比较1/EC 20，微滤的毒性削减率为29.9%㊂但是经臭氧消毒后，细胞毒性反而升高了10.8%㊂与发光菌急性毒性测试结果一致，提示可能在臭氧消毒过程中产生了毒性较强的消毒副产物㊂与本研究结果相似，有文献报道臭氧消毒处理后，污水对大鼠的急性毒性[12]和细胞遗传毒性升高[13]㊂但也有研究与本研究结果不同，加拿大蒙特利尔某污水处理厂的臭氧消毒工艺使雌激素活性降低98.0%以上，雄激素活性去除68.0%以上，而抗雌激素活性保持不变[14]㊂表明废水的特性可能
会影响臭氧消毒过程中毒性的变化㊂
海口某湿地公园F 的水样的细胞毒性随着再生水萃取物浓度的升高而降低㊂进水的细胞毒性(抑制率)范围为42.7%~54.0%，出水用于当地景观湖的生态补给，其细胞毒性为50.4%~84.9%㊂比较各工艺排水的1/EC 20，预处理和人工湿地对水体污染的细胞毒性削减率分别为45.1%和49.4%，总削减率为72.
3%㊂结果表明该生态修复工艺对于二级处理工艺排水中有毒有害物质能够进一步去除㊂出水用于湖泊和河流生态补给，有利于提高再生水景观回用的安全性㊂
. All Rights Rerved.
第5期宋京洋等：代表性二级处理㊁三级处理和湿地生态修复技术对城镇污水人源干细胞毒性的削减83
㊀. All Rights Rerved.
图2㊀城镇二级㊁三级污水厂和湿地修复技术水样有机萃取物对发光菌和人骨髓间充质干细胞(hBMSCs)
毒性效应的浓度-效应关系
注:REF表示相对富集倍数,NC表示阴性对照；数据代表平均值ʃ样本标准误差(SE),n=3;*Pɤ0.05㊁公司股份合作协议
**Pɤ0.01㊁***Pɤ0.001，与对照组相比㊂
Fig.2㊀Concentration-respon relationship of the toxicity caud by organic extractions of water samples from urban
condary and tertiary wage treatment plants and wetland effluents in luminescent bacteria and human stem cells
Note:REF stands for related fold enrichment;NC stands for negative control;data reprents meanʃSE,n=3;
*Pɤ0.05,**Pɤ0.01,***Pɤ0.001,compared with the control.
