冰片对P—糖蛋白的影响
：鱼:————
我们¨1曾报道DN辨证主要包括肝脾肾气阴亏
虚，气滞血瘀，湿浊内停等.因此，健脾滋肾，理气
养血，化瘀利湿是其治疗大法.小四五颗粒所含小柴
胡汤能疏通三焦，理气和解，五苓散能通阳化气，利
水渗湿，四物汤具养血活血去瘀之功.而小柴胡汤与
五芩散二方相合即为《丹溪心法》的柴苓汤，临床与
实验研究均证实其对肾损伤具有肯定的保护作用,
再加四物汤，具有脾肾双补，攻补兼施，阴阳相济的
特点，可气行瘀去，清升浊降，水湿归于正化，使尿
白蛋白减少，肾功能得到改善.对小四五颗粒治疗
DN的机理，我们临床研究证实，小四五颗粒对DN
鼠标动不了的治疗功效与血管紧张素转换酶(ACE)基因多态性
相关，而血管紧张素系统不仅可影响肾脏血流动力
学，更可通过众多细胞因子途径，影响肾脏细胞增
殖.因此其疗效机制可能通过影响血管紧张素系统,
阻断肾脏增殖系统，从而减轻肾脏肥大，减轻肾实质
楚楚可人冰片对P一糖蛋白的影响
与临床药理2003年3月第14卷第2
增生.本实验进一步证实其与ACE抑制剂肾保护功
效类似，其确切作用机理，尚须进一步研究.
参考文献:
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陈艳明，王宁生(F-~kH中医药大学临床药理研究所，广州510405)
摘要：目的评价冰片对P一糖蛋白(P—glycoprotein,P—gP)活性的作用.方法制备含冰片的家兔血清，用MD.
CK(犬肾)和Hela(人子宫癌)细胞系作为评价载体，以维拉帕米作阳性对照药，用M1Tr法观察其对长春新碱所
致细胞毒性的作用.结果在MDCK和Hela两种细胞系上，冰片均能明显地增强长春新碱所致的细胞毒性，作用
与维拉帕米相似.结论冰片对P—gP的活性有明显地抑制作用.
关键词：冰片/药理学;@P一糖蛋白;@MDCK细胞;@Hela细胞
中图分类号:R285.5文献标识码:A文章编号:1003—9783(2003)02—0096—04
P—gP是多药耐药基因(MuhidrugResistance
gene,MDR)编码的一种主要表达产物，分子量为
170kDa，在肿瘤细胞膜上有大量的表达，是肿瘤细
胞耐药的主要机制.后来发现在其他的器官和组织也
有P—gP的大量表达，如血脑屏障(Blood—brain
barrier,BBB)，小肠，肾等¨-6].大量的研究表明
P—gp也是BBB的一个有机组成部分，对脂溶性物质
的跨BBB转运发挥着非常重要的作用，如一些抗癌
药，抗精神病药等I～1.
冰片由龙脑香科龙脑香(Dryobalanopsaromatica
Gaertn.F.)的树脂和挥发油等加工而成，或由樟
脑，松节油等经化学合成而得.冰片味辛苦，性微
寒，具有开窍醒神，清热止痛的功效.传统中医药
理论认为，冰片”独行则势弱，佐使则有功”.许
多用于心脑血管及中枢神经系统疾病的中成药都含
有冰片，如安官牛黄丸，至宝丹，冠心苏合香丸
等.在安宫牛黄丸和至宝丹中冰片尚有协助牛黄,
麝香”内透包膜”之功效.同位素方法研究表明,
冰片于胃肠道，皮肤，粘膜均易被吸收，在体内与
葡萄糖醛酸结合后排出体外.H一冰片口服后能迅
速透过小鼠BBB1.本研究所早期采用气相色谱
法，放射免疫法,CT动态扫描等对冰片的体内过程
进行了深入研究，发现冰片不但本身极易透过BBB,
还能促进其他某些大分子亲水性物质(Evan’sblue,
收稿日期:2002—09—06
鳕鱼营养价值
作者简介：陈艳明(1974一)，男，博士研究生；王宁生(1946一)，男，课题负责人，教授，博士生导师，从事药物体内分析，药物动力
学，中药安全性等研究2O余年.
基金项目：广东省自然科学基金课题(编号980644).
土垫堑垫墨壅垫墨旦箜查笠塑
泛影葡胺，庆大霉素等)透过BBB，证明了冰片确
邺城
实能开放BBB,”】.为进一步探讨冰片开放BBB的
机理，本实验用长春新碱10nmol?L造成细胞毒
性模型，然后用维拉帕米作为阳性对照药观察冰片对
P—gP的影响…t”】，在MDCK,Hela两种细胞系上同
时进行，以探讨冰片对P—gP的影响.
1材料和方法
1.1材料
1.1.1试剂与药品DMEM,Hyclone公司，批号
紫草的功效AMJ11206L；新生小牛血清,LifeTechnologies，批号1067635；长春新碱(VCR)，广州明兴制药厂，批
号010701；维拉帕米(V er)，上海禾丰制药有限公
司，批号00301;M1Tr,sigma公司；十二磺酸钠(SDS),Amresco公司；冰片(Bor)，为机制冰片,
主要含有龙脑和异龙脑.其他试剂均为分纯;Hela
细胞系为本所提供;MDCK细胞系购于中国预防医学科学院.
1.1.2仪器酶联免疫仪,Tecangenios公司，型
号:Speetraflourplus;CO2培养箱,Sanyo公司；纯
水机,Mili—Qplus；柱子为Milipore公司，批号
FLSN29754.
1.1.3冰片含药血清的制备雄性新西兰家兔(购
于广州中医药大学实验动物中心)，灌服冰片l0
g/kgt’.,”】，每天1次，连续4d，于末次给药后1h
取血，静置离心，上清液过0.22Ixm的微孔滤膜即
得冰片血清.用气相色谱法测得冰片的浓度为133.33Ixg?mL～.空白血清用同样方法取于同一受
试兔给药前的血清.VCR和V er则用含l0%新生牛
血清的DMEM培养液溶解至所需浓度备用.
1.2方法Hela细胞和MDCK细胞均于DMEM(低糖)培养液中培养(含l0%小牛血清,IOOU/mL青
比较英语霉素和100U/mL链霉素)，传1～3代后应用于实验.Hela细胞和MDCK细胞分别接种于96孔板上. 接种细胞浓度为1X10/mL，体积为100L，留4
孔不接种细胞而加相应体积的培养液，用于去除96 孔培养板的本底.于接种的第2天将培养孔中的培养液吸走，加含VCR的培养液100L，预留6孔做正
常对照(接种了细胞的培养孔),VCR有5和l0 nmol?L两个浓度(终浓度).于不同时间点加冰
片血清或V er，冰片血清的作用时间分别为48,24,4 h，同时有5%和l0%两种浓度;V er有20,50和
100Ixmol?L3种浓度，作用时间均为4h，正常对
照则加新鲜培养液，体积均为100L.到时间后,
97?
每孔加入MTT10L，继续培养4h后，结束培养,
吸弃100L培养液，加入20%SDS100L，室温
过夜.第2天于570nm比色(酶联免疫仪).
1.3阳性药和造模药剂量的选择在接种了Hela细
胞的培养板中，每孔加5或10nmol?LVCR100
L(正常对照组除外)，并于相应时间点加20,
50,100I~mol?L的V er或DMEM100L，每组4
孔，然后于酶标仪上测定OD值.结果10nmol?L
的VCR能对Hela细胞造成明显的细胞毒性，与对照组比较有显着性异(P<0.01)，而5nmol?L的
VCR不能造成细胞毒性;50和100I~mol?L的V er
均能增强VCR的细胞毒性，与模型组比较有显着性差异(P<0.01)，故以100I~mol?L为阳性对照
药维拉帕米的剂量.
1.4统计学方法用SPSS统计软件处理，做ONEWAY ANOV A分析.
2结果
2.1冰片对Hela细胞P—gp活性的影响在接种了Hela细胞的培养板中，每孔加10nmol?LVCR100
L(正常对照组和空白血清对照组除外)，并于相
应时间点分别加入5%,l0%的冰片100L,100
I~mol?L的V er100L，空白家兔血清100L.然
后于酶标仪上测定OD值.结果表明5%和l0%的
冰片血清在不同的时间点均能增强VCR的细胞毒性，与模型组和正常对照组比较都有显着性差异(P <0.01)；空白血清组则没有此作用，与正常对照组
比较,P>0.05，与模型组比较,P<0.01.冰片不
同浓度和时间点之间的作用比较无差异(P>
0.05)，见图1.所以，冰片能抑制Hela细胞膜上
P—gP的活性，抑制VCR从Hela细胞内的外排，从
而增强VCR对Hela细胞的毒性.
困5%Bor组
10%Bor组
圆v.r组
模型组
■正常对照组
口血清对照组
,\
塞睡莲的诗句
量
..
：
蚕葛，量量i
图1冰片对Hela细胞P—gP活性的影响
注：与正常对照组比较,P<0.01；与模型组比较.’P<
0.01；与空白血清对照组比较,P<0.01,=4.
2.2冰片对MDCK细胞P—gp活性的影响在接种
：苎:————
MDCK细胞培养板中，每孔中加10nmol?LVCR
东方医药巨典100L(正常对照组和空白血清对照组除外)，于相
应时间点分别加入5%,l0%的冰片100L,100
I~mol?L的V er100I-LL，空白家兔血清100L，然
后于酶标仪上测定OD值.结果表明l0%的冰片血
清作用24h后能明显增强VCR的细胞毒性，与模型
组和正常对照组比较都有显着性差异(P<0.01),
而空白家兔血清则没有此作用.但冰片不同浓度和时
间点之间无差异(P>0.05)，见图2.结果表明,
冰片能抑制Hela细胞膜上P—gP的活性，抑制VCR
从Hela细胞内的外排，从而增强VCR对Hela细胞
的毒性.
MDCK细胞经药物处理后，加MTY试剂37℃
理2003g-3月弟14卷第2
孵育4h，光镜结果见图3，经VCR造模的MDCK细
胞明显地生长缓慢，代谢物结晶少，冰片和V er则能
增强这种作用.在Hela细胞上也有相似结果.
正常对照组血清对照组模型组v组B组
图2冰片对MDCK细胞P—gp活性的影响
注：与正常对照组比较,’P<0.Ol；与模型组比较,’P’
0.O1.n:4.
鞠图3冰片对MDCK细胞作用的光镜观察结果
a.对照组,
b.血清对照组,C.模型组,d.5%冰片组,C.10%冰片,￡V er组3讨论
P—gP是MDR基因的表达产物广泛地存在于各种
肿瘤细胞膜和一些正常的细胞膜上，如BBB，小肠
上皮细胞等.哺乳动物的MDR是一个小的基因家
族，虽然有多于70%的序列是同源的，但总体可分
为两大类，即ClassI和ClassII.ClassI包括人类的
MDR1，小鼠的MDRla,MDRlb和仓鼠pgpl,pgp2
_7?H和MDR2.研究表明MDR1,MDRla和
MDRlb基因参与多药耐药性，而MDR2则不引起多
药耐药.P—gP是一种药物外排泵，具有A TP依赖
性，能把进入细胞内的特定药物分子大量地排出细
胞外，从而使细胞免受药物的作用，特点是对底物
的特异性低，两个底物之间有竞争性，从而抑制P—
gp对底物的外排作用，故他的底物也叫做MDR逆转
剂或P—gP抑制剂，如环胞素A(CyclosporinA),
V er，地塞米松等¨.早前的研究结果表明P—gP是
BBB屏障作用的重要组成部分.P—gP能将细胞内的
某些药物分子主动地排出细胞外，并且它在细胞上
成极化分布，也就是说它能定向地外排某些特定的
物质，在BBB则是单向的排出到脑微血管腔内，从
而阻止了物质向中枢的分布，达到屏障的作用.本
室的研究证明冰片能开放BBB，为探求冰片开放
