血清蛋白醋酸纤维薄膜电泳的影响因素分析
程驰;赵兴秀
【摘 要】血清蛋白醋酸纤维薄膜电泳常因多种因素影响而出现区带分离不清晰、拖尾、区带歪斜、区带呈锯齿状或弯曲等现象。该文结合教学实践,对造成不理想电泳图谱常见影响因素进行分析,提出相应的解决方法,有助于改进实验教学效果。%Common problems such as unclear zone paration, trailing, askew zigzag or curved zones are often encountered in electrophoresis of rum proteins on cellulo acetate membrane due to various factors. Combined with the teaching practice, such influencing factors are analyzed in detail and corresponding measures are put forward. All of the will help to improve the experimental teaching effect.
【期刊名称】《实验科学与技术》
【年(卷),期】2012(010)003
【总页数】3页(P24-26)
【关键词】醋酸纤维素薄膜电泳;血清蛋白;影响因素;对策
【作 者】程驰;赵兴秀
【作者单位】四川理工学院生物工程学院,四川自贡643000 四川大学生命科学学院,成都610064;四川理工学院生物工程学院,四川自贡643000
【正文语种】中 文
【中图分类】Q-33;Q5
电泳是生物化学的一项基本技术。因具有吸附少、电渗作用小、快速省时和成本低等优点,以醋酸纤维薄膜为支持物进行电泳分离血清蛋白已成为生化教学必开的基础实验项目之一。但影响该实验的因素较多,往往因考虑不周而得不到理想的电泳图谱,主要表现为区带分离不清晰、拖尾、区带歪斜、区带呈锯齿状等。笔者结合生化实验教学经验及他人研究工作,对影响实验效果的常见因素进行分析并提出相应对策,以供参考。
科学馆正常情况下,血清蛋白电泳后分离成5个较明显的条带:清蛋白、α1-球蛋白,α2-球蛋白,
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β-球蛋白和γ-球蛋白。但溶血标本则表现为清蛋白含量下降,α2-球蛋白和β-球蛋白含量升高且区带分离不清,随溶血程度的增加,血红蛋白浓度达到2.50 g/L时,α2-球蛋白和β-球蛋白区带重叠,呈现出电泳扫描图中的α2-β桥,严重溶血时α2-β桥融合为一个波峰[1]。琼脂糖凝胶电泳结果显示,血红蛋白会迁移到α2-球蛋白和β-球蛋白区带之间,从而使后两者的检测结果增高,所以应取用无溶血的血清标本。以笔者所在的生化实验室为例来描述血清标本的制备,即取洁净的100 mL离心管到菜市接取健康兔血后,常温静置至血液凝固,5 000 r/m,离心5 min,上清液即为血清,小心移取分装,-20℃冻存备用。实验结果表明,血清蛋白分离效果良好。
血清蛋白中除清蛋白外,其他的大多数都是糖蛋白[2]。这些糖蛋白通过N-或O-连接的寡糖链增强了蛋白分子空间构象的稳定性,在一定程度上提高了抵抗蛋白水解酶的能力,半衰期延长[3]。尽管在2℃~8℃保存,血清中多种酶的存在仍会分解蛋白,尤其像清蛋白这样缺乏对酶抵抗力血清蛋白,使血清蛋白质的组分发生改变,蛋白质的分解同时也引起电荷下降,使α2-球蛋白的电泳速度变慢[4]。研究表明,血清在2℃~8℃的条件下保存48 h对电泳结果影响较小;在3~5 d内,除γ-球蛋白外,其他4种蛋白的质量百分比均出现了显著性变化(P<0.05)[5]。在笔者实际教学中,发现血清在-20℃下冻存7 美丽的海底世界
d也未见降解,但分装保存在4℃的血清确实最好在2 d内使用才能保证分离效果。
血清蛋白醋酸纤维素薄膜电泳对缓冲液的pH值和离子强度要求严格。离子强度愈低,区带展开愈长,电泳速度愈快,带电颗粒在介质上扩散严重,可分辨性明显降低,区带展开延长,导致区带拖尾[6-7]。当离子强度低于0.05时会出现区带拖尾现象,高于0.075时,区带则过于紧密。虽然交换电极或是将缓冲液混合后滤过再使用有一定改善作用,但应该经常测试缓冲液的pH值和离子强度,尤其是阳极端的pH值变化,而且最好在电泳6次后就更换新的缓冲液[8-9]。
研究发现,在相同条件下,采用与巴比妥—巴比妥钠缓冲液pH值和离子强度相同的硼酸缓冲液能得到更清晰的图谱,表明这样的硼酸缓冲液是一种更经济环保的替代溶液[10]。
属于流动负债的是如果对血清蛋白醋酸纤维薄膜电泳实验的要求不高,像笔者所在的地方理工高校所开设的生化实验,只要求得到5条清晰可辨的蛋白区带即可。若要进行病理分析或得到更多区带的话,可基于不连续缓冲系统的原理,以氯离子作为前导离子,巴比妥离子作为后向离子,所产生的较大电势梯度使血清样品浓缩,血清蛋白分辨率可大大提高,非病理血清即可分出6~8条明显区带[11]。
纪检干部厚薄不均,糙面微孔不均,脆性不一的纤维素膜将导致区带泳动速度稳定,蛋白质在白色斑点处甚至不泳动而造成区带分离不清晰,出现区带跑歪的现象。因此应选用漂浮于缓冲液后能迅速浸润且色泽一致的薄膜。浸泡充分的薄膜如果过湿则会因样品扩散迅速,浓度降低而导致区带分散不集中。因此,在用滤纸轻吸膜片表面多余缓冲液时,应以不干不湿为宜,因为吸得太干的薄膜(醋酸纤维薄膜出现白斑)渗透性会变差,样品不易进入醋酸纤维素网孔内而达不到分离量。
从人为因素来看,因点样造成的蛋白分离失败所占比例最高。点样量太多时容易导致电泳图谱分离不良或产生拖尾现象;点样量太少,区带则模糊不清[12]。点样失败,一方面是点样器自身缺陷;另一方面同时也是主要方面,即熟练度不够。用载玻片端面点样,会因其宽度略大于薄膜宽度而产生明显的边缘效应,并有拖尾现象。如采用改制较窄的订书针端面或毛细管点样,效果明显优于载玻片端面点样[13]。在实验教学中,笔者用宽度打磨成1.5 cm左右的盖玻片采用印章法点样的效果也不错。点样时力度不均或蘸取样品太多,在膜上分布不匀会引起区带歪斜或边流,因此要求学生在滤纸上多练习点样是十分必要的。
另外,点样时还应辨别光泽面和无光泽面。若点在光泽面上,血清不能渗入醋酸纤维薄膜微孔内,将导致电泳图谱不清晰。笔者在准备时提前在干膜片光泽面的一端标上序号,无光泽面标上+号,并提醒学生注意在这+号面画线点样,这样就不易混淆,也便于实验评分。
薄膜在滤纸桥上的位置歪斜会引起区带歪斜和边流。当薄膜两端与盐桥接触不紧密,存在小缝隙,薄膜不同位置电阻不一致而导致电流强度不同,出现同一区带的不同位点的迁移速度差异而造成锯齿状区带;当膜两端与盐桥接触程度不同时就会出现歪斜和边流。此外,由于膜的扩散作用和边缘效应,搭桥时薄膜相互挤靠也会引起区带跑歪的现象。因此,搭桥时薄膜与电流方向平行并与滤纸桥接触紧密,并保证上样点位置悬空,不与阴极盐桥相重叠,因为来自电极缓冲液的流动会改变部分低荷质比血清蛋白的电泳行为[14]。但通常电场力决定蛋白质电泳行为,缓冲液流动对蛋白质电泳行为影响太小而难观察到[15-16]。搭桥后还应盖上电泳槽盖平衡10 min,以保证薄膜湿度均匀。
电压及电流的正确选择对于区带的清晰分离十分必要。电压过高,虽可缩短时间,但图谱展开距离短,蛋白质各组分之间出现挤压,区分困难;反之,以低电压进行电泳时,样品泳动速度慢并且容易扩散,图谱常出现拖尾现象。
影响质点迁移率的因素有多种,包括带电质点的性质、电场强度、缓冲液的黏度、温度、pH值和离子强度以及固体支持物的电渗现象等。由于醋酸纤维薄膜电渗很小,假定缓冲液性质稳定,此时影响质点迁移的主要因素便是电场强度。电泳速度与电场强度和电流强度成正比,电压增加,电流也相应增大,从而加速电泳。但电流过大时,血清蛋白运动快但区带却分不开,产生的热效应足够高的话甚至会使血清蛋白变性而不能分离[17]。有资料认为,实际操作时应根据具体的电泳设备性能,按电场强度6~8 mV/cm长(指薄膜与滤纸桥总长度),0.4~0.8 mA/cm宽(薄膜数目的总宽度)来设定电压,以控制电流效果在10 mA为佳。也有研究采用先细调到0.4 mA/cm膜宽,然后电泳10 min,再调到0.6 mA/cm膜宽,然后电泳70 min,可得到清晰可见的电泳图谱[18]。此外,还应根据室温对电压适当调整[19-20]。大象无形
染色与漂洗充分与否也会影响蛋白区带的清晰程度。由于清蛋白在血清蛋白中的含量高,染色时间短会造成清蛋白区带中间色浅的现象。染色液重复使用次数过多或存放时间过长以及薄膜粘黏,也会使蛋白区带染色不均,出现空泡样。染料配制过程中,将氨基黑10 B的用量增加30并贮存较长时间再用会提高染色效果,但需振摇染色充分。
实践表明,将染色充分的薄膜依次在盛有漂洗液的三个培养皿中分别来回漂洗几次,将减少脱色时长。虽然研究认为温度提高会加快蛋白质的洗脱,但漂洗温度不应超过25℃。实际操作发现,若无定量要求,一般情况下,室温漂洗并不影响区带的清晰度[21]。
尽管血清蛋白醋酸纤维薄膜电泳实验的影响因素较多,但在实际操作中,只要结合生物化学理论知识和对电泳原理的深入理解,就能够及时准确地分析问题的原因并对实验操作和器材进行调整,得到良好的实验结果。
【相关文献】
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