植物转录因子与DNA互作研究技术特邀专家方法，值得收藏！
植物按照中心法则完成遗传信息的转录和翻译。不同基因型的个体通过将DNA转录为RNA, RNA进一步翻译为蛋白质, 从而表现出不同的表型。其中, 起始转录步骤的成功与否影响着后续步骤(如RNA的可变剪接以及翻译)的进行(Latchman, 2005)。因此, 转录在植物生命过程中发挥至关重要的作用。此外, 转录还能调控基因的组织特异性表达以及基因表达对特定信号的响应, 进而影响器官的分化以及植物对环境的适应性。转录过程一直是生命科学研究中的热点问题。近年来, 大量研究从转录调控的角度解析了植物对热、冷和干旱等胁迫信号以及对外源光信号的响应机制(Pu and Brady, 2010; Nakashima et al., 2014; Ohama et al., 2017; 杨立文等, 2019)。在转录调控机制的解析过程中, 酵母单杂交(yeast one hybrid, Y1H)、凝胶阻滞迁移率检测(electrophoresis mobility shift assay, EMSA)和瞬时表达是行之有效的技术手段。
Y1H和EMSA是检测转录因子能否直接结合DNA的常用技术。Y1H是酵母双杂交的衍生技术, 用于分析转录因子与DNA之间的相互作用, 以研究真核细胞中的基因表达调控(Li and Herskowitz, 1993)。在Y1H分析系统中, 将特定顺式作用元件构建到pLacZ2μ酵母表达载体上,
将编码转录因子的cDNA构建到pB42AD酵母表达载体上。将上述2种融合表达载体共转化至酵母细胞中, 此时转录因子若能结合在顺式作用元件上, 则会启动下游报告基因的表达。目前, Y1H技术主要用于鉴定DNA结合位点, 筛选潜在的DNA结合蛋白(转录因子), 因操作简单且耗时短受到研究者的青睐。然而, 在利用Y1H分析转录因子与DNA的结合时可能受到酵母内源表达激活物的影响, 即存在假阳性问题。此外, 由于融合蛋白对酵母细胞有毒性或者在酵母系统中不能稳定表达等原因, Y1H会产生假阴性结果。在实际操作中, 可通过设置严格的对照实验减少假阳性和假阴性结果的干扰。EMSA是另一种研究转录因子与DNA结合的实验技术, 可用于定性和定量分析。通常将纯化的蛋白和同位素或生物素标记的DNA探针共同孵育, 然后在非变性聚丙烯凝胶上电泳, 从而将DNA-转录因子复合物与不结合的探针分离。由于分子量变大, DNA-转录因子复合物比不结合的探针迁移速度慢, 因此转录因子结合标记探针后使自由探针含量减少。研究者通常按照上述2个标准判断转录因子是否结合DNA。然而, EMSA很难鉴定低亲和力的结合元件; 也无法鉴定蛋白复合体与DNA之间的结合。此外, 作为体外检测手段, EMSA不能反映体内蛋白与DNA的结合。
瞬时表达体系是检测转录因子对下游基因调控作用(促进或抑制)的技术方法。通常包括本氏烟草(Nicotiana benthamiana怎么了简谱)和拟南芥(Arabidopsis thaliana)原生质体2种操作体系。利
用本氏烟草瞬时表达体系分析转录因子对基因的表达调控时, 将融合编码转录因子cDNA的双元表达载体以及融合特异基因启动子-LUC报告基因的表达载体共同转化烟草叶片。若转录因子调控该基因的表达, 那么下游报告基因LUC的表达将发生变化, 进而导致其编码的荧光素酶活性改变, 可通过体外喷施荧光素酶底物进一步检测这种变化。利用拟南芥原生质体瞬时表达体系分析转录因子对基因的表达调控时, 首先将编码转录因子的cDNA构建至pUC18-3HA载体上, 然后将特异基因启动子序列构建至pGreenII0800-LUC载体上。pGreenII0800-LUC载体含有编码萤火虫荧光素酶(LUC)以及海肾荧光素酶(REN)的基因序列。REN基因由35S启动子驱动, 其编码的REN与底物反应产生的荧光读数(LUC文化墙设计Renilla)作为内参。LUC基因由外源插入的基因启动子驱动, 其催化底物产生的荧光值读数为LUCFirefly。以LUC拼音dFirefly/LUCRenilla比值表示转录因子对基因的转录调控作用。目前, 瞬时表达体系由于其操作简便和表达效率高等优点备受研究者青睐。此外, 相比获得永久性的转基因材料, 瞬时表达的外源基因不会遗传给下一代, 因而生物安全性很高。
1 实验材料
Y1H: 包括酵母(Saccharomyces cerevisiae) EGY48菌株(Clontech)、pLacZ2μ和pB42AD
酵母表达质粒(图1A, B)。其中, pLacZ2μ连接增强复制的特异元件; pB42AD连接转录因子的编码区序列。EMSA: 包括表达质粒(图1C)、携带表达质粒的BL21大肠杆菌菌株和DNA探针序列。瞬时转化体系: 包括3–4周苗龄的本氏烟草叶片以及拟南芥莲座叶片。在烟草体系中, 利用双元表达载体质粒以及连接启动子片段或特异元件的植物表达载体(图1D, E)进行瞬时转化。在拟南芥原生质体体系中, pUC18-3HA连接编码转录因子的cDNA; pGreenII0800-LUC连接特异基因启动子片段或特异元件(图1F, G), 用于原生质体瞬时转化。
图1 表达载体示意图
(A) pB42AD (Clontech); (B) pLacZ2µ (Lin et al., 2007); (C) pET-28a (Novagen); (D) pRI-GFP (Jing et al., 2019); (E) pCAMBIA1302-LUC (Xu et al., 2019); (F) pUC18-3HA (Chen et al., 2013); (G) pGreenII0800-LUC (Hellens et al., 2005)。MCS:多克隆位点; REN: Renilla
Figure 1 Construct maps
(A) pB42AD (Clontech); (B) pLacZ2µ (Lin et al., 2007); (C) pET-28a (Novagen); (D) pRI-GFP (Jing et al., 2019); (E) pCAMBIA1302-LUC (Xu et al., 2019); (F) pUC18-3HA (Chen et al., 2013); (G) pGreenII0800-LUC (Hellens et al., 2005). MCS: Multiple cloning site; REN: Renilla
2 试剂及配方
(1) Y1H所需试剂包括YPD酵母全营养培养基、One-step溶液、酵母缺陷型培养基(SD)、棉子糖、半乳糖、10× BU盐以及5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷(X-gal)。相关试剂的配方
如下。
∙YPD酵母全营养培养基: 20 g∙L–1 Difco peptone、10 g∙L–1酵母抽提物和20 g∙L–1葡萄糖。相关试剂均购自OXOID公司。
∙SD培养基: 6.7 g∙L–1 YNBOXOID、20 g∙L–1葡萄糖(Cat No.GAO188)、20 g∙L–1琼脂以及缺少色氨酸和尿嘧啶的氨基酸混合物(DO/Trp-Ura) (Cat No.630427)。
∙显色SD培养基: 在SD培养基(不包含葡萄糖)中加入1× BU盐、2%半乳糖、1%棉子糖和80μg∙mL–1 X-gal。其中, 10× BU盐: 37.1g∙L–1 Na2HPO4和30 g∙L–1 NaH2PO4。相关试剂均购自Sigma公司。
∙One-step溶液(现用现配): 2 mL1 mol沙盘比赛>淮山粥的做法∙L–1 LiAc (Sigma)、8 mL 50% PEG3350 (Cat No.BCBX- 6102)以及76.9 µL β-巯基乙醇(Cat No. M8210)。(2) EMSA所需试剂包括: 5× TBE、6% TBE凝胶、生物素标记试剂盒(ThermoScientific, Cat No.89818)、EMSA试剂盒(LightShift, Cat No.20148)和化学发光核酸检测试剂盒(ThermoScientific, Cat No.89880)。其中, 相关试剂的配方如下。瞬间爆发力
∙5× TBE: 54 g∙L–1 Tris、27.5g∙L–1硼酸以及0.5 mol·L–1 EDTA (pH8.0)。
∙6% TBE凝胶(25 mL): 2.5 mL 5× TBE、5 mL30%丙烯酰胺(Cat No.A3291)、17.325 mL ddH2O、150 μL10% APS (Cat No.MKCG5404)和25 μL TEMED (Cat No.T22500)。(3) 瞬时表达体系包括本氏烟草和拟南芥原生质体2种转化系统。
∙本氏烟草系统所需试剂:LB液体培养基、注射缓冲液(10 mmol∙L–1 MgCl2校园游记、10 mmol刘晓庆身高∙L–1 MES pH5.7)、乙酰丁香酮(acetosyringone, AS)、Triton X-100和荧光素(D-luciferin)。
∙拟南芥原生质体瞬时转化体系所需试剂:W5、WI、PEG4000和MMG溶液。相关试剂配制方法参考文献报道(Yoo et al., 2007)。
