超高效液相色谱法测定Menaquinone-7原料药主成分及有关物质
宋怡;孔凡建;李银科;王泉
【摘 要】Raw material drug of Menaquinone-7 was dissolved ultrasonically with ethanol in the dark,and then the principal compound and related substances in the sample were parated on an Agilent Eclip plus C18 chromatographic column (2.1 mm× 50 mm,1.8 μm).The mobile pha was methanol-water (98+2) solution,and the detection wavelengths were 246,270 nm for the determination of principal compound and related substances,respectively.The linearity range of Menaquinone-7 was 0.005-0.400 g · L-1,with detection limit (3S/N) of 0.1 mg · L-1.Recovery rates obtained by standard addition method were in the range of 98.8％-100％ and RSDs (n=6) were less than 1.0％.The contents of the principal compound in 2 batches of Menaquinone-7 raw material drug were 98.0％ and 98.2％.The mass fraction of single impurity was less than 0.5％,and the mass fraction of total impurities was less than 1.0 ％.%Menaquinone-7原料药在避光条件下经无水乙醇超声溶解后,采用Agilent Eclip plus C18色谱柱(2.1 mm×50 mm,1.8μm)分离主成分及有关物质,
以甲醇-水(98+2)混合液为流动相,分别在波长246,270 nm处测定主成分及有关物质.Menaquinone-7的线性范围在0.005～0.400 g·L-1内,检出限(3S/N)为0.1 mg· L-1.加标回收率在98.8％～100％之间,测定值的相对标准偏差(n=6)小于1.0％.测得两批Menaquinone-7原料药中主成分的质量分数分别为98.0％,98.2％,单个杂质质量分数小于0.5％,杂质总质量分数小于1.0％.
【期刊名称】《理化检验-化学分册》
【年(卷),期】2017(053)012
俄罗斯饮食【总页数】5页(P1381-1385)
【关键词】超高效液相色谱法;Menaquinone-7;主成分;有关物质
【作 者】宋怡;孔凡建;李银科;王泉
【作者单位】云南省玉溪市食品药品检验所,玉溪653100;云南省玉溪市食品药品检验所,玉溪653100;玉溪师范学院,玉溪653100;玉溪师范学院,玉溪653100
【正文语种】中 文
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【中图分类】O657.7咋挽留爱情
维生素K是一类天然存在的脂溶性维生素，维生素K 2（甲基萘醌类，Menaquinone，简称MK）是一组在2-甲基-1，4-萘醌母核上有不同长度的聚异戊二烯侧链的化合物。Menaquinone-7（MK-7）属于维生素K 2中的一类，它的侧链含有7个异戊二烯基团，结构式见图1。
维生素 K 2 主要通过微生物发酵产生［1－2］，也可由人工合成得到［3］。研究发现，维生素K 2具有治疗和预防骨质疏松［4－6］、促进凝血等功能［7］，同时在治疗肝癌［8－9］、乳腺癌［10］等方面表现出良好的疗效。MK-7作为维生素K 2最重要的一类，还具有防止血管钙化，降低冠状动脉心脏病的风险［11］，以及治疗类风湿性关节炎的功能［12］。
图1 MK-7的结构式Fig．1 Structural f or mula of MK-7
目前，尚未见到用超高效液相色谱法测定MK-7原料药主成分及有关物质的报道。本工作参
考了国外对母乳、血液、食品中维生素K 2的测定方法［13－17］，应用超高相液相色谱分析技术对 MK-7原料药主成分及有关物质进行测定，拟为MK-7质量标准的制定提供参考。
1 试验部分
1．1 仪器与试剂
Agilent 1290 Infinity型超高效液相色谱系统，配二极管阵列检测器（DAD）和Open LAB CDS工作站；TB-215D型十万分之一电子天平；Elga型超纯水机。
对照品溶液：避光操作，称取 MK-7对照品25．21 mg置于25 mL棕色容量瓶中，加无水乙醇超声溶解并稀释至刻度，摇匀，制成对照品储备溶液。移取1．00 mL对照品储备溶液，置于10 mL棕色容量瓶中，加无水乙醇稀释至刻度，摇匀，作为对照品溶液。
MK-7对照品纯度为99．1%，无水乙醇、异丙醇为分析纯，甲醇为色谱纯，试验用水为超纯水。燕园是哪个大学
1．2 仪器工作条件
Agilent Eclip pl us C18 色谱柱 （2．1 mm×50 mm，1．8μm）；流动相为甲醇-水（98＋2）混合液；流量0．3 mL·min－1；检测波长为246 n m（主成分测定），270 n m（有关物质测定）；柱温30℃；进样量2μL。
1．3 试验方法
避光条件下，称取MK-7原料药25．12 mg置于25 mL棕色容量瓶中，加无水乙醇超声溶解并定容，摇匀，制成供试品储备溶液。移取供试品储备溶液1．00 mL置于10 mL棕色容量瓶中，用无水乙醇稀释至刻度，摇匀，配制供试品溶液，在仪器工作条件下进行测定。
移取4．00 mL供试品储备溶液，置于10 mL棕色容量瓶中，加无水乙醇稀释至刻度，摇匀，作为有关物质供试品溶液。移取上述溶液1．00 mL置于50 mL棕色容量瓶中，加无水乙醇稀释至刻度，摇匀，作为有关物质对照溶液，在仪器工作条件下进行测定。
2 结果与讨论
2．1 检测波长的选择
采用二极管阵列检测器对供试品溶液在波长200～400 n m内进行扫描，发现在波长246，270 n m处有最大吸收，见图2。
图2 MK-7紫外吸收光谱Fig．2 UV adsorption spectru m of MK-7
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由图2可知：在波长246 n m处，杂质较少，无干扰；在270 n m处，杂质有明显吸收，且基线噪声较小。试验选择270 n m为有关物质的检测波长，246 n m为MK-7的检测波长。
2．2 溶剂的选择
分别用异丙醇、甲醇、无水乙醇溶解并稀释供试品，制成3份质量浓度为0．1 g·L－1的溶液，按仪器工作条件进样分析。3份溶液的峰形及对称性均较好，而异丙醇和无水乙醇能较快溶解样品，甲醇溶解样品的时间较长。从经济性方面考虑，试验选择无水乙醇作为溶剂。
2．3 专属性考察
取0．2 g·L－1供试品溶液共5份，1份在70℃恒温水浴中加热1 h，作为高温破坏溶液；1份
在4300lx的强光下照射1 h，作为光照破坏溶液；其余3份分别加入0．1 mol·L－1盐酸溶液、0．1 mol·L－1氢氧化钠溶液、30 g·L－1过氧化氢溶液各1 mL加热1 h，并调节p H至中性，分别作为酸破坏溶液、碱破坏溶液、氧化破坏溶液。将5份专属性溶液和1份0．2 g·L－1供试品溶液按仪器工作条件，在波长270 n m下进样分析，色谱图见图3。
图3 不同条件下MK-7专属性试验的色谱图Fig．3 Chro matograms of specificity test of MK-7 under different conditions
由图3可知：MK-7在酸、碱、光照、高温及氧化条件下均不稳定，不同程度分解而产生杂质；但在上述色谱条件下各杂质峰与主成分峰均能较好地分离，对MK-7及有关物质的测定无干扰，说明建立的方法具有良好的专属性。由图3还可知：MK-7在碱性条件下几乎完全分解，在光照下产生的杂质较多，说明该物质对光敏感，易被碱破坏，故在生产、运输和储存的过程中应采取避光措施，并避免与碱性物质的接触。
2．4 系统适用性试验
分别将对照品溶液、供试品溶液和空白溶液，按仪器工作条件在波长246 n m处进样分析，
色谱图见图4。MK-7的保留时间为7．05 min，理论塔板数为10 889，拖尾因子为0．94。
2．5 方法学考察
2．5．1 线性范围与检出限
移取MK-7对照品储备溶液适量，配制成质量浓度分别为0．005，0．010，0．025，0．050，0．100，0．200，0．400 g·L－1的对照品溶液系列，按仪器工作条件在波长246 n m处进样分析，记录色谱图及峰面积。以峰面积为纵坐标（y）和MK-7质量浓度为横坐标（x）进行线性回归，MK-7的线性范围为0．005～0．400 g·L－1，线性回归方程为y＝1．430×10 4 x－3．620×10 1，相关系数为0．999 8。
按3倍信噪比时的质量浓度计算得检出限（3S／N）为0．1 mg·L－1。
图4 对照品溶液、供试品溶液、空白溶液的色谱图Fig．4 Chr o matograms of standard solution，sa mple solution and blank solution
2．5．2 精密度试验
貂蝉带什么技能平行配制6份供试品溶液，在波长246 n m处进样分析，测得MK-7质量分数的平均值为98．0%，相对标准偏差（RSD）为0．6%，说明方法的精密度较高。
2．5．3 稳定性试验
取供试品溶液，在10℃下避光保存12 h，每隔2 h进样一次，按仪器工作条件在波长246 n m处分析，测得MK-7峰面积的RSD为0．7%。说明供试品溶液在12 h内，10℃避光条件下稳定性良好。
2．5．4 回收试验
称取MK-7供试品适量，按试验方法进行加标回收试验，结果见表1。
表1 回收试验结果Tab．1 Results of test for recovery本底值ρ／（g·L－1）加标量ρ／（g·L－1）测定总量ρ／（g·L－1）回收率／%0．108 3 0．050 0 0．157 7 98．8 0．101 2 0．099 9 0．201 2 100 0．102 1 0．150 0 0．250 9 98．8
2．6 样品分析
称取2批MK-7原料药，按试验方法配制供试品溶液，在波长246 n m处进样分析。按外标法以峰面积计算MK-7的质量分数，结果见表2。
表2 样品中MK-7的测定结果（n＝3）Tab．2 Deter mination results of MK-7 in sa mples（n＝3）样品批号 测定值w／%RSD／%20160101 98．0 0．5 20160623 98．2 0．6英语演讲稿
2．7 有关物质测定
称取2批MK-7原料药，按试验方法配制有关物质溶液，移取对照溶液2μL，在波长270 n m处进样分析，调节检测灵敏度，使主成分色谱峰的峰高约为满量程的25%，再移取有关物质供试品溶液和对照品溶液各2μL，按仪器工作条件进样分析，记录色谱图至主成分保留时间的3倍，以自身对照法计算杂质含量，结果见表3。
