第37卷第5期
2020年10月
实验动物科学
LABORATORY ANIMAL SCIENCE
Vol . 37 No . 5 October 2020
非洲绿猴和食蟹猴主要肠道细菌的
实时定量P C R 检测及分析+
周小军尚艳姣王进王爽邱业峰
(军事科学院军事医学研究院实验动物中心，北京100071)
非洲绿猴具有不同于食蟹猴和恒河猴等猕猴的生物学特征，如脂质代谢、自发性高血压、SIV 感染不引
起获得性免疫缺陷综合症（AIDS )等，本研究拟对食蟹猴和非洲绿猴肠道细菌的相对含量进行比较研究。方法 随机选取SIV 抗体阴性的成年食蟹猴和非洲绿猴各12只，排除肥胖和疾病个体，收集其新鲜粪便样本，按200 mg 每份等分后进行液氮速冻，-80丈保存。其中1份进行肠道细菌的实时定量PC R 分析。结果与食蟹猴相比，非 洲绿猴双歧杆菌、乳酸菌以及肠杆菌相对含量显著偏低（P <〇. 05)，而普氏菌以及丁酸盐产生菌—
普拉梭菌和真
细菌相对含量更高（P <〇. 05)。结论非洲绿猴产丁酸盐的细菌相对含量更高，反映出其肠道免疫细胞稳态和黏 膜完整性具有不同于食蟹猴的进化适应特征，为深入研究非洲绿猴对SIV 感染不致病的相关机制奠定了基础。 关键词：非洲绿猴；食蟹猴；肠道菌群；SIV;AIDS 中图分类号：Q 95-336
文献标识码：A
文章编号：1006-6179(2020)05-0031-05
D O I ：10. 3969/j . issn . 1006-6179.2020. 05.006
人类免疫缺陷病毒（h u m a n immunodeficiency
vim s , H I V )感染会导致获得性免疫缺陷综合征
(acquired immunodeficiency syndrome , A I D S )，具有 极高的病死率m , A I D S 的发病机制尚未完全阐明。猴免疫缺陷病毒（simian immunodeficiency virus ,
S I V )与H I V 密切同源，S I V 天然宿主包括乌白眉猴、
非洲绿猴、山魈u _3]等，研究天然宿主对S I V 感染的 适应性机制，有助于A I D S 致病机制研究、降低H I V 的母婴传播、指导H I V 疫苗开发，以及改善对HI V 感染者的长期治疗。胤禄
肠道菌群与人体健康密切相关，肠道菌群参与 人类的许多生理过程，如宿主代谢、自身免疫和过 敏、大脑发育与神经交互等^1，此外肠道菌群组成 差异还与H I V 感染的预防和干预以及抗P D 1肿瘤 治疗等有效性相关1781。最近一项研究显示，非洲 绿猴在S I V 感染早期会快速激活并维持其粘膜组织 中的再生性伤口愈合机制，提示肠道屏障完整性可 能在其对S I V 感染适应性中发挥重要作用[9]。本研 究拟对非洲绿猴和食蟹猴肠道细菌的相对含量进行
收稿日期：2020-06-12
•基金项目：国家科技重大专项“艾滋病和病毒性肝炎等重大传染病防治”（N 〇.2017ZX 10304402003003)
作者简介：周小军（1983—)，男，助理研究员，研究方询：实验动物检测及动物模型研究.E -mail : Z
理赔中心houxiaojun 320320@ 126. com 通信作者：邱业峰（1980—)，男，副研究员，长期从事实验动物教学及科学研究.E -mail :qiU yefeng 2001@
比较研究，以明确非洲绿猴肠道菌群特征及其在
s i v 感染适应过程中的作用。
1材料与方法
l .i
实验动物
本中心饲养健康成年非洲绿猴和食蟹猴各12
只，排除肥胖个体，普通级，5 ~ 8岁[S C X K (军） 2012-0019]。每日词喂全价营养颗粒料，辅以清洁 水果，自由饮水。
趴在桌子上睡觉1.2方法
1.2.1粪便样本采集：每只动物收集其新鲜粪便样
本，按每份200 m g 等分后进行液氮速冻，转运至 -80 T 冰箱保存。1.2.2
粪便样本D N A 提取：采用Q I A a m p
PowerFecal D N A K i t 进行粪便样本D N A 提取，
-80 t 冰箱保存。
1.2.3粪便样本D N A 实时定量P C R 分析：采用实 时定量 P C R 体系（20 jxL )包括 10 (jl L S Y B R Green
令研究报告令
摘要：目的
• 32 •实验动物科学双歧杆菌
C M
A G M C M
A G M
I ------------1
I ------------1
肠杆菌
拟杆菌-普氏菌群
图1非洲绿猴（A G M )和食蟹猴（CM )主要肠道细菌相对含量比较
注：横坐标表示动物分组，A G M 和C M 分别为非洲绿猴组和食蟹猴组；纵坐标表示细菌相对含量
Fig. 1 Comparsion of the relative abundance of main gut bacteria in AGM and CM
Note： The abscissa reprents groups while A G M stands for African green money group and C M stands for cynomolgus macaque group；
the ordinate reprents the relative abundance of main gut bacteria
1.2.4统计方法：相对定量分析采用A A C t 法，组 0.05为显著性差异，统计和作图软件采用GmphPacl
间相对丰度倍数之间差异性分析采用《检验，
Prism 5。
C M
A G M
I ------------1
乳酸菌
37卷
Realtime P C K Master M i x , 300 nmol /L 正反向弓丨物， 采集设定为80 t 、丨0 s 以排除引物二聚体等干扰:300 n g 粪便样本D N A ，其余用d d H 20补足。实时定 针对16 s r D N A 区域设计实时定量P C R 引物，引物 量P C R 反应条件为：95 t 、3 m i n ，95丈、30 s ，退火 序列和退火温度见表1。
40 s ,72 T ：、30 s ,40个循环，72冗、5 m i n ，荧光信号
表1
实时定量P C R 引物序列和退火温度
Table 1 The list of primers and annealing temperatures ud in the real-time PCR
针对肠道细菌种类序
列
3J
退火温度/丈
普拉梭菌
G A T G G C C T C G C G T C C G A T T A G C C G A A G A C C T T C T T C C T C C 58
双歧杆菌
G G G T G G T A A T G C C G G A T G
T A A G C C A T G G A C T T T C A C A C C 59
乳酸菌
A G C A G T A G G G A A T C T T C C A
A T T T C A C C G C T A C A C A T G
58
肠杆菌
C A T T G A C G T T A C C C G C A G A A G A A G C
C T C T A C G A G A C T C A A G C T T G C 63
拟杆菌-普氏菌群
G A A G G T C C C C C A A T T G
C A A T C G G A G T T C T T C G T G 56
真细菌
A C T C C T A C G G G A G G C A G C A G T
A T T A C C G C G G C T G C T G G C
56
A
B
^<0.05
P<0.05
第5期周小军等：非洲绿猴和食蟹猴主要肠道细菌的实时定量P C R检测及分析.33 .
2结果
2.1非洲绿猴和食蟹猴主要肠道细菌相对含量比较
与食蟹猴相比，非洲绿猴双歧杆菌相对含量显著偏低（比值0.7, P<0. 05)，乳酸菌相对含量显著偏低（比值0.6, _P<0. 05)，肠杆菌相对含量显著偏低（比值〇.5，P<0. 05)，拟杆菌-普氏菌相对含量显
P<0.05
C M A G M
I------------1
普拉梭菌著偏高（比值2.4，P<0.05)。
2.2非洲绿猴和食蟹猴主要产丁酸盐细菌相对含量比较
与食蟹猴相比，非洲绿猴主要产丁酸盐肠道细菌普拉梭菌相对含量显著偏高（比值3.4, P< 0.05)，真细菌相对含量显著偏高（比值1.3，P< 0.05)。肠道细菌产生短链脂肪酸、涉及代谢通路及产生菌信息
见表2。
B
^<0.05
图2 非洲绿猴（AGM)和食蟹猴（CM)主要产丁酸盐肠道细菌相对含量比较
注：横坐标表示动物分组，A G M和C M分别为非洲绿猴组和食蟹猴组；纵坐标表示产r酸盐细菌相对含量
Fig. 2 Comparison of the relative abundance of butyrate-producing bacteria in AGM and CM Note：the abscissa reprents groups while A G M stands for African green money group and C M stands for cynomolgus macaque group;
the ordinate reprents the relative abundance of butyrate-producing gut bacteria
表2短链脂肪酸种类、涉及通路及产生菌信息
Table 2 List of short-chain fatty acids, related pathways and producing bacteria
短链脂肪酸种类通路或反应产生菌
乙酸盐来自通过乙酰辅酶A的丙酮酸盐
途径
W o o(丨-Ljungdahi 通路
琥珀酸盐通路
丙烯酸盐通路
大部分肠道细菌，如嗜黏蛋白阿克曼菌、拟杆菌、
球菌113
布劳特氏菌属氢营养菌，梭状芽孢杆菌，链球菌[14
拟杆菌，考拉杆菌，小杆菌，韦荣氏球菌；13
埃氏巨型球菌，灵巧粪球菌[13
双歧杆菌、普氏菌、瘤胃
丙酸盐丙二醇通路
磷酸丁酰转移酶/ 丁酸激酶途径沙门氏菌，食葡糖罗斯拜瑞氏菌，卵瘤胃球菌15伴生粪球菌，规则粪球菌16
丁酸盐丁酰辅酶A；乙酰辅酶A转移酶途径厌氧棒状菌，灵巧粪球菌，直肠真杆菌，霍氏真杆菌，普拉梭菌，罗氏菌13
3讨论
S I V是与H I V-1和H I V-2相对应的灵长类动物 免疫缺陷病毒的总称，大量研究表明，S I V在过去几 十年中多次跨越种属屏障传播给人，在人群中进化、分化为具有不同流行和致病特征的各种H I V毒 株S I V利用C D4分子作为受体，以及C C R5, C X C R4或者C C R2之一作为共受体感染非人灵长类动物in~]。S1V感染导致猕猴等非天然宿主引发A I D S，却不会在天然宿主中造成进展性疾病。S1V 天然宿主具有许多共性免疫学特征，其中T细胞上C D4表达的下调在包括非洲绿猴在内的一些S I V天 然宿主中表现为进化上的保守性[14]。一项新近研究比较了恒河猴和非洲绿猴在S I V急性感染期肠道 组织表达谱差异，发现非洲绿猴在S I V感染早期会快速激活并维持其黏膜组织中的再生性伤口愈合机制，也提示肠道屏障完整性可能在其对S1V感染适 应性中发挥重要作用[9]。
人固有一死
研究非人灵长类动物肠道菌群具有一定的转化 医学价值，早期和慢性期H1V感染病人的肠道菌群组成发生明显改变M51，猕猴等非人灵长类动物在S I V感染早期的肠道炎症反应与肠道菌群变化与H I V急性感染病人相似[161 ，而S1V感染慢性期非
人
.34 .实验动物科学37卷
灵长类动物肠道菌群组成变化趋势与H I V慢性期 病人符合性相对较低[17]。
非人灵长类动物肠道菌群组成以及各菌门间的 优势趋势与多数其他哺乳动物相似[18]，不同非人灵 长类动物的肠道菌群组成在科和属水平上的相似度 要比门水平低得多。研究表明，非人灵长类动物肠道菌群组成不仅具有宿主物种特异性，而且在很大 程度上能反映宿主的系统发育关系U9_21]。尽管食 性（肉食性、植食性、杂食性）影响非人灵长类肠道菌群组成，一项对18种野生非人灵长类动物肠道菌 群的比较研究显示，宿主饮食生态位对灵长类菌群组成和功能的影响微弱，宿主系统发育和生理影响更大[22]。非洲绿猴在自发性高血压、脂质代谢以及 对S I V感染的致病性方面等具有显著不同于食蟹猴 的生物学特性[23_24]，提示非洲绿猴和食蟹猴在肠道菌群组成上可能具有特征性差异。
本研究结果显示，与食蟹猴相比，非洲绿猴双歧 杆菌、乳酸菌以及肠杆菌相对含量显著偏低（<P< 〇.〇5)，而普氏菌以及丁酸盐产生菌—普拉梭菌和真细菌相对含量更高（P<〇.05)。肠道菌群与代谢和肠道稳态密切相关，肠道菌群的代谢产物短链脂肪酸（short-chain fatty acids,S C F A s)，如乙酸盐、丙酸盐、丁酸盐，影响肠道免疫细胞稳态[25]，其中丁 酸盐通过对肠道表皮细胞和免疫细胞发挥抗炎效果，进而影响肠道稳态和健康126]。产丁酸盐的细菌 包括灵巧粪球菌、直肠真杆菌、霍氏真杆菌、普拉梭 菌、罗氏菌等[27]。研究显示，在S I V急性感染猕猴以及H I V慢性感染病人中，普氏菌相对含量显著上升，而乳酸菌相对含量显著下降[~32]，与本研究中非洲绿猴特征相似。另外，非洲绿猴产丁酸盐的细菌相对含量更高，反映出其肠道免疫细胞稳态和黏膜完整性具有不同于食蟹猴的进化适应特征，这可 能是非洲绿猴作为S I V天然宿主长期自然进化选择 的结果，也为深人研究非洲绿猴的肠道菌群与代谢的相互作用及其对S I V感染进化适应的相关机制奠 定了基础。
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Real-time PCR Detection and Analysis of the Gut Microbiota in
African Green Monkey and Cynomolgus Macaque
Z H O U Xiaojun,S H A N G Y a n-jiao,W A N G Jin,W A N G Shu a n g,Q I U Yefeng
(Laboratory Animal Center o f the Academy o f Military Medical Sciences, Beijing 100071 , China)
Abstract ：Objective As a SIV natural host,African green monkey(A G M )shows A I D S resistance.Also, spontaneous hypertension develops in A G M.Different capacities in lipid metabolism between A G M and Cynomolgus macaque (C M)exist.This study aims to characterize the gut microbiome profiles of A G M and C M.Method Fecal samples were collected for 12 A G M and 12 C M.Real-time P C R detection of the main gut bacteria in A G M and C M was performed and analyzed.Result Our results demonstrated a lower abundance of Bifidobacteria and a higher abundance of Prevotella in A G M.Compared with C M,A G M possd a higher abundance of the butyrate-producing Faecalibacterium prausnitzii and Eubacteria(P< 0.05 ).Conclusion Compared with C M,the gut microbiota of A G M rembles a trend as found in early SIV infection or chronic H I V infection.A G M posss a relative higher abundance of the butyrate-producing gut bacteria which correlates with gut homeostasis and mucosal integrity.The findings ma y provide insight into environmental adaption and A I D S resistance in A G M.
Key words：African green monkey；Cynomolgus macaque；gut microbiota;SIV；A I D S
