[成分分析]
藏药紫花龙胆中龙胆苦苷的LC 2M S 定性和HP LC 定量分析
梁向艳, 田 琼, 李超峰
(第四军医大学药理教研室，陕西西安710032)
收稿日期:2005205225
作者简介：梁向艳(1978～)，女，河南人，硕士生，从事中药药理研究。电话:0292833747662808 E 2mail: 通讯作者：田 琼，电话:029********* E 2mail:Tqi ong@f mmu .edu
关键词:LC 2MS;M S/M S；紫花龙胆；龙胆苦苷
摘要：目的：对藏药紫花龙胆提取液中龙胆苦苷成分进行定性分析和含量测定。方法：利用高效液相色谱2电喷雾2质谱/质谱(HP LC 2ESI 2M S/M S )联用结合LC 2DAD 2UV 技术，通过和标准化合物龙胆苦苷的保留时间、紫外吸收光谱以及质谱中的准分子离子峰[M +H ]+相对照，快速鉴定了紫花龙胆提取液中的龙胆苦苷成分[1]。对其含量的测定则采用了毛细管高效液相色谱方法。结果：一级质谱扫
描结果表明紫花龙胆甲醇提取液中主要有5个峰，第一个峰化合物结构为龙胆苦苷，准分子离子峰[M +H ]+为356.9，毛细管高效液相色谱结果表明藏药紫花龙胆中龙胆苦苷成分的百分含量为
1.97。结论：藏药紫花龙胆中龙胆苦苷是其主要成分。
中图分类号:R284.1 文献标识码:A 文章编号:100121528(2006)0420548204
Gen ti op i crosi de con ten t i n v i olet Gen ti a n by LC 2M S and HPLC
L I A NG Xiang 2yan 1
, TI A N Q i ong 2
, L I Chao 2feng
3
(D epart m ent of Phar m acology,Fourth M ilitary M edical U niversity,X i’a n 710032,China )
KE Y WO R D S :LC 2MS;MS/MS;vi olent gentiana;genti op icr oside
ABSTRACT:A I M :To identify and quantitative analysis genti op icr oside content in the extract of V i olent gentian of Tibetan herbal medicine .M ETHOD S :App licati on of HP LC 2the electricity s p rays f og 2mass s pectr oscopy/mass s pectr oscopy (HP LC 2ESI 2MS/MS )and the technique of LC 2DAD 2UV,by contrast with the rervati on ti m e of the authentic genti op icr oside,the ultravi olet abs orbed s pectru m ,the molecule[M +H ]+
,quickly identified the genti op i 2cr oside in the extract of vi olent gentian .A s t o it’s quantitative analyis we adop ted the cap illary HP LC methods,with the weight of authentic genti op icr oside f or abscissa .RESUL TS :MS showed that the methanol extract of vi olet gen 2tian mainly had five peaks .the compound structure of first peak was genti op icr oside,molecule[M +H ]+
356.9,re 2
sult showed that genti op icr oside in gentian was 1.97.CO NCL US I O N :Genti op icr oside is the mainly component
of vi olet Gentia .
龙胆是一种常用中药，其根中含有龙胆苦苷成分，药理实验表明龙胆苦苷(genti op icr oside GTP )具
有促进胃液分泌、抗炎、利胆和杀微生物等作用，是龙胆的主要有效成分。紫花龙胆生长在海拔4000米左右的西藏高原，是龙胆属龙胆类植物，其花为紫色，作为藏药以其地上部分的花、茎、叶入药。《晶珠本草》记载龙胆花解毒治各种喉症，性味苦、寒无毒，主治咳嗽、气管炎、天花、咽喉肿痛等属藏药榜间类[2]
高速怎么收费标准，以其花色不同分为白花龙胆、兰花龙胆、黑花龙胆，未见紫花龙胆的记载。榜间类均属高山型植
物，用法独特，疗效确实，有文献报道新藏成药十味
龙胆花颗粒在临床应用中对慢性支气管炎、儿童肺
部感染有良好的疗效[3,4]
，龙胆花是其方中主药。本文利用HP LC 2ESI 2MS/MS 技术分离鉴定了藏药紫花龙胆的地上部分包括花、茎、叶提取液中的龙胆苦苷成分，对其含量的测定则采用了毛细管高效液相色谱方法。1 仪器与材料
仪器高效液相色谱仪,Agilent 1100ries；紫外检测器,G1315B 2DAD；柱温箱,G1316A；色谱柱C 18
8计算机审计
荣耀是华为的吗
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毛细管柱(150mm ×0.5mm I D ),Agilent 1100ries 带加热的自动进样器；离子阱质谱，电喷雾接口，质
谱仪Agilent 1100ries LC /MS D Trap；数据处理系统,Agilent che m stati on 。
水为超纯水，甲醇为色谱纯，乙酸为分析纯。标准品龙胆苦苷自中国药品生物制品检定所购得。
生药样品自西藏采得，俗名紫花龙胆，生药原植物学名正在鉴定中。2 方法与结果2.1 定性分析2.1.1 实验条件
液相色谱条件：流动相，甲醇2水(15∶85)甲醇中含0.5乙酸；柱温40°C；检测波长275nm；流速10μL /m in；进样量0.2μl 。梯度洗脱,[Ti m e (m in ):C (MeOH )]为[0.00:15.0]2[6.00:20.0]2[20.0:40.0]2[30.0:60.0]2[35.0:15.0]。质谱条件：高纯氮气,15.0p si；干燥气,5.01/m in；喷雾电压,3k V；温度,325°C；扫描方式，正离子扫描；扫描范围,100～1000m /z 。2.1.2 提取液中主要成分的分离
流动相条件经优化选择，选择甲醇2水梯度洗脱,30m in 内可将各组分较好分离，液相色谱图和总离子流图如图1～2。其中组分1与龙胆苦苷标准品对照，均在17m in 出峰，并且紫外吸收光谱一致，在275n m 处均有最大吸收峰。(图3～6)
。
图1 样品HP LC 色谱图
F i g .1 HP LC chro ma togram of s am
ple
图2 龙胆花提取液中主要成分总离子流色谱图
F i g .2 HP LC 2ES I 2M S ana lysis of the ch i ef co m positi on s of
the flower of gen ti a na extracti
on
图3 龙胆苦苷标准品液相色谱图
F i g .3 HP LC chro ma togram of reference subst ance
GTP
图4 龙胆苦苷标准品总离子流色谱图
F i g .4 HP LC 2ES I 2M S ana lysis of the reference subst ance
GTP
图5 龙胆苦苷紫外吸收光谱图
F i g .5 UV absorpti on spectrogram of
GTP
双子男和双子女图6 组分1吸收光谱图
F i g .6 UV absorpti on spectrogram of co m positi on 1
2.1.3 提取液中龙胆苦苷分子量测定
图7为提取液中组分1质谱扫描图，图9为龙
胆苦苷标准品质谱扫描图，两者的准分子离子峰[M
+H ]+
相同均为356.9。图中红色标记为系统选定
9
45
的两个母离子，其中194.8为基峰。再比较两者的
二级质谱碎片离子扫描图(图8,10)，从图中可看出两者二级质谱碎片扫描基本相同，可认定两者是同一成分
。
图7 组分1的M S 图
F i g .7 Full scan m ea ss spectra of co m positi on
1
图8 组分1的M S /M S 图
F i g .8 The M S /M S spectra of co m positi on 1
图9 龙胆苦苷标准品的M S 图
F i g .9 Full scan ma ss spectra of reference subst ance GTP
图10 龙胆苦苷标准品的M S /M S 图
F i g .10 The M S /M S spectra of reference subst ance GTP
猪肉串
2.2 定量分析2.2.1 液相色谱条件
流动相：甲醇2水(15∶85)；柱温:40°C；检测波
长:275n m；流速:10μL /m in；压力:0～150bar 。梯度洗脱:[Ti m e (m in ):C (Me OH )]为[0.00:15.0]2[6.00:20.0]2[20.0:40.0]2[30.0:60.0]2[35.0:15.0]。2.2.2 标准曲线的制备精密称取龙胆苦
苷10mg，用甲醇定容于10mL 棕色量瓶中，超声溶解30m in 。用加样枪取3mL 入
10mL 棕色量瓶中，加甲醇至刻度，微孔滤膜过滤,
得标准溶液。分别以0.1μL,0.2μL,0.3μL,0.4μL,0.5μL 进样，进行分析测定，由数据处理机给出峰面积值。以标准品的重量为横坐标，测得的峰面积为纵坐标，作标准曲线，得到经过原点的直线。线性范围在30～150ng 。标准曲线的相关系数为0.9999显示了良好的线性关系。见表1。
表1 龙胆苦苷的线性关系(L i n ear rel a ti on sh i p for
deter m i n a ti on of gn ti op i crosi de)
V (μL )Am t (ng ×10-4)
Peak area (A ×10-4)
0.100.00300.273910.200.00600.583500.300.00900.883700.400.0120 1.186400.500.0150
1.48200
r =0.9999L inear regressi on
Y =100.636X -0.023822
2.2.3 精密度试验：取线性范围内高中低3个量进
行检测。用0.2mg/mL,0.4mg /mL,0.6mg/mL 3
个浓度的标准品溶液以0.2μL 进样，每个浓度测量5次，结果见表2。
2.2.4 重复性试验：分别称取生药龙胆花粉200mg，共5份，按生药测定项下所述的方法测定，计算
x 、s 、RSD 。结果见表3。
2.2.5 稳定性试验：取样品供试品溶液，室温下每
隔2h 进样1次，共进样6次，按生药测定项下所述的方法测定，结果见表4。
2.2.6 加样回收试验：精密称取干燥的龙胆花粉末200mg，共4份。其中3份加入一定量的龙胆苦苷标准品(取线性范围内高中低3个量)，按生药测定
项下所述的方法测定龙胆苦苷的含量，计算回收率。
见表5。2.2.7 生药测定：精密称取干燥的龙胆花粉末(60目，石油醚脱脂，干燥)200mg，分别放入50mL 离心管中，加甲醇20mL，超声提取40m in，离心分离(半小时)滤过。分别取滤液10mL 入10mL 棕色量瓶中，得样品溶液，避光，低温贮存备用。以0.2μL 进样，进行分析测定。由于标准曲线为通过原点的直线，故采用外标一点法进行测定。计算公式如下:
C
=
VW s
V s检讨书格式
W ・100 W s 为微机处理机测得相当于标准品重量(μg )的值;W 为生药样品的称样量(mg );V s 为进样体积(μL );V 为生药提取液体积。
藏药龙胆花中龙胆苦苷成分的含量测定结果为1.97(n =3)，见表6。
55
表2 龙胆苦苷的精密度试验(Prec isi on test of peak area
A×10-4for gen ti op i crosi de)
C(mg/mL)A×10-4 x S RSD()
0.60 1.18381 1.182920.010.85
1.17690
1.19034
1.18507
1.17843
0.400.765910.782450.01 1.30
0.78813
0.79206
0.77965
0.78649
0.200.381410.37830.00330.87
0.37490
0.37501
0.38164
0.37872
表3 样品的重复性试验(Repetiti ve test of
peak are A×10-4for s am ple)
样品Peak area(A×10-4)Am t(ng×10-4)
10.368660.0039
20.376710.0040
30.382240.0040
40.369850.0039
50.370500.0039
x=0.00395
S=0.00005
RSD()=1.56
表4 样品稳定性试验(St ab ility test of peak area
A×10-4for s am ple)
n Peak area(A×10-4)Am t(ng×10-4)
10.381090.00402
20.375460.00397
30.378780.00400
40.382010.00403
50.374850.00396
60.375250.00397
X=0.00399
S=0.00003
RSD()=0.67
表5 龙胆苦苷加样回收试验(Recover i es of
added gen ti op i crosi de)
Added(mg)Found(mg) x S RSD()Recovery
1.03 1.02 1.030.010.97100.0
1.02
1.04
1.03
1.03
4.03 4.04 4.030.010.25100.0
4.03
4.04
4.02
4.03
8.038.038.070.040.50100.5
8.06
8.06
8.06
8.14表6 紫花龙胆中龙胆苦苷含量测定(M ea sur i n g
gen ti opli crosi de of v i olen t gen ti a na)
样品V(μL)Peak area(A×10-4)Am t(ng×10-4)
1
0.200.370060.0039
0.200.368860.0039
0.200.369810.0039
2
0.200.378850.0040
0.200.371610.0039
0.200.381240.0040
3
0.200.369600.0039
0.200.370850.0039
0.200.371270.0039
3 讨论
3.1 对传统藏药运用HP LC2ES12MS/MS这一技术我们能较便捷的分析其药效成分，为阐明其功效提供一定的理论依据。本实验成功分离了藏药紫花龙胆提取液中的各个组分，获得了大量的离子信息，并快速鉴定了其中龙胆苦苷成分。
3.2 对于龙胆苦苷成分的提取，考虑到其花中的脂溶性成分，故先用石油醚回流提取1h。对其热敏感性，则采用室温超声波提取，此种提取方法有文献表明效果较好[4]。对于紫花龙胆提取液中各成分的
分离，由于采用了毛细管高效液相色谱法，组分出峰时间太早，使用文献中常规液相所采用的流动相甲醇和水，乙腈、醋酸和水的不同配比，均无法将龙胆苦苷与其他化学成分分开。于是又试验了乙腈和水，甲醇和水的一系列不同浓度洗脱程序，最后找到了甲醇和水的一种浓度梯度，在柱温40°C时[4]将各个组分得到了良好的分离。
3.3 中国药典收载的龙胆入药为根，其龙胆苦苷含量较高，本实验结果表明藏药紫花龙胆中龙胆苦苷含量为1.97，比中药龙胆的含量低，龙胆苦苷是否作为藏药紫花龙胆药理作用的主要药效成分尚未见文献报道。藏药理论是我国医药卫生事业中的一颗璀璨明珠，作为地区用药的藏药紫花龙胆，除了对其化学成分进行鉴定以及含量方面的评价外，还应结合药理实验进行深入探讨。
参考文献:
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成分的高效液相色谱定量分析[J ].药学学报,1991,26(11):
8642870.
加味四妙丸中总有机酸总量测定及分离纯化研究
3
尹 莲, 杨大凯, 裘颖儿难忘的小学生活作文600字六年级
(南京中医药大学药学院江苏南京210029)
收稿日期:2005201230
基金项目：江苏省自然科学基金项目(BK2002033).
作者简介：尹 莲(1962～)，女，副教授，研究方向：中药复方化学，电话:025*********。
关键词：加味四妙丸；总有机酸；电位滴定法；阴离子交换树脂法
摘要：目的：为研究治疗痛风加味四妙丸的质量标准及药效物质基础，对该处方中有机酸部位进行总量测定及分离纯化研究。方法：建立电位滴定法测定加味四妙丸中有机酸含量。比较用强碱型阴离子交换树脂法、石2硫法及大孔树脂法分离纯化有机酸提取物的方法。结果：用电位滴定法测定该处方有机酸含量较准确，平均加样回收率101.5，处方药中
有机酸含量为0.23。结论：用强碱型阴离子交换树脂法分离纯化有机酸部位的方法最好，提取物纯度为88.9
，纯化
得率为89.1。
中图分类号:R927.2 文献标识码:A 文章编号:100121528(2006)0420552203
四妙丸出自清代・张秉成的《成方便读》，由黄柏、苍术、牛膝、薏苡仁组成，临床常用四妙丸加味治
疗急性痛风[1]
，经尿酸钠微晶诱导的大鼠急性痛风
模型筛选[2]
及临床验证，已筛选确定四妙丸加味的有效处方，对急性痛风的治疗尤其突出，并具有显著的抗炎、镇痛、降尿酸作用。据文献报道，该处方加味药含以绿原酸、阿魏酸为主的苯丙酸类及莽草酸等水溶性有机酸，并具有抗炎作用。因此，建立有机酸总量测定方法并进行分离纯化研究，以进一步研究该处方中总有机酸的药效活性。并探索出中药水溶性有机酸的总量测定及分离纯化方法。本研究采用电位滴定法测定有机酸总量，比较石2硫法、大孔树脂纯化法、强碱型阴离子交换树脂法分离纯化该处方中总有机酸提取物工艺。1 仪器、药材及药品仪器:Z D 22型自动电位滴定计:Z D 21型滴定装置;231型玻璃电极一支;232型甘汞电极一支；旋转蒸发仪(上海亚荣)。
药材：黄柏(Phell odendr on chinen Schneid .)，苍术(A tractyl odes chinensis Koidz .)，薏苡仁(Corx Lacry ma 2j obi L.var .ma 2yuen )，牛膝(Achyranthes bidintata B1.)及加味药均自购，由南京中医药大学药学院中药鉴定教研室王春根教授鉴定。
标准品：乙酰水杨酸(纯度>99.5)标准溶液
立春几点
0.0103mol/L 。
试剂：标准氢氧化钠溶液0.0815mol/L；邻苯二甲酸缓冲溶液pH =4(25°C )，其它试剂均为分析纯。2 方法与结果2.1 电位滴定法总量测定2.1.1 电位突跃范围模拟试验
取30.00mL 浓度为0.0103mol/L 的标准乙酰水杨酸、溶液于50mL 烧杯中，将烧杯置电磁搅拌器的磁盘上，浸入电极.搅拌下逐滴加入浓度为0.0815mol/L 的标准氢氧化钠溶液，分阶段记录电位。当单位体积碱溶液引起电位变化值较大时，小心慢慢加入碱溶液，继续滴定一段时间，直到电位变化不大为止。记录所消耗碱溶液体积和电位值，以电位的变化量(ΔE )和体积的变化量(ΔV )的比值为纵坐标，电位变化前后所用的氢氧化钠溶液的体积
的平均值(V )为横坐标作图，绘制ΔE /
ΔV ～V 电位曲线图，结果见图1。曲线的极大值就是滴定终点，消耗碱量为3.75mL 。由公式V 碱=C 酸・V 酸/C 碱，计算得碱消耗量为3.76mL，二者基本吻合，曲线显示滴定终点非常明显。
2
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