-基础研究•
缺氧诱导脂滴相关蛋白在糖尿病合并腹主动脉瘤中的表达
田丽杨柳刘肖叶春芳1，孟宪杰打李会S张丽华S张瑾瑾2，马冬1*
(]唐山市人民医院内分泌科，河北唐山06300I；2华北理工大学公共卫生学院，河北唐山0632I0)
!摘要】目的通过生物信息学方法，寻找糖尿病合并腹主动脉瘤(AAA)患者中差异表达的基因，明确其功能，探讨发病机制。方法从Gene Expression Omnibus"GEO)数据库中下载人糖尿病GSE2I32I和人腹主动脉瘤GSE7084数据集，以"< 0.05及表达变化>2.0倍标准筛选差异基因。联合运用Gencript数据库和predictpstein平台分析蛋白质亚细胞定位，并通过荧光共定位实验进行验证'STRING数据库分析缺氧诱导脂滴相关蛋白(HIPDA)的相互作用。采用SPSS I3.0软件进行数据分析，计量资料差异比较采用方差分析。结果筛选出HILPDA基因(在2型糖尿病中上调II.35倍，腹主动脉瘤中上调6.4倍)'亚细胞定位结果预测HIPDA多分布于细胞核和线粒体中，荧光染色共定位分析证实了HILPDA在血管平滑肌细胞的细胞核和线粒体中有较高的表达；蛋白质互作网络分析证实HILPDA相关蛋白与细胞对缺氧的反应、脂质滴相关。与瘤旁动脉组织(对照组)比较，在糖尿病合并AAA患者组织中HILPDA蛋白的高表达更为显著[(47.2±5.6)%和(7I.5±4.7)%, "<0.0I)]%结论HILPDA基因对糖尿病合并腹主动脉瘤的诊断和治疗的临床研究可能具有潜在的指导价值％
!关键词】糖尿病,2型；腹主动脉瘤；缺氧诱导脂滴相关蛋白
【中图分类号】R732.2I[文献标志码】A[DOI】I0.II9I5/j.issn.I67IY403.202I.06.094
Expression of hypoxia-inducinir lipid droplet-associated protein in diabetic patients combiner with abdominal aortic aneurysm
TINN LP,YANG Liu1,LIN Xiao1,YE Chun-Cang1,MENG Xian-Jic1,LI Hui1,ZHANG Li-Hua1, ZHANG Jin-Jin2,MA Dong2*
(1Department of Endocrinology,Tangshan Peoplef Hospital,Tangshan06300I,Hebei Province,China；2School of Public Health, North China University of Science and Technology,Tangshan0632I0,Hebei Province,China
)Abstract]Objective To find the dyFerenCally expresd genes(DEGs)in diabetic patients combined with abdominal aortic aneurysms(AAA)through bioinformatics analysis,then clarify their functions,and explore the roles in the pathogenesis.Methods The eepee s ion peooiyesooGSE21321(diabeiesme i ius)and GSE7084(AAA)weeedownyoaded oeomiheGeneEepee s ion Omnibus(GEO) daiaba.The2miceoa e a ydaiaisweeeiniegeaied ioobiain DEGsbysceeeningai"<0.05and eepee s
ion changesgeeaieeihan2iimes. Thesubce u yaeyocayieaiion ooobiained peoieinswasanayyeed byusingGensceipidaiabaand Peedicipeoiein pyaiooem,which weeeoueihee eeeioied wiih oyuoeescenceco-yocayieaiion anayysis.Thepeoiein inieeaciionsoohypoeia-inducibyeyipid deopyei-a s ociaied(HILPDA)weee anayyeed byiheaech iooyooeiheeeieieayooinieeaciinggenes(STRING)daiaba.SPSS siaiisiics13.0wasud ooedaiaanayysis. DiPerenco of measurement data was compared with analysis of variance.RespUs HILPDA was screen out,with up-revulaXon by 11.35iimesin iype2diabeiesme i iusand by6.4iimesin AAA.Theeesuyisoosubce u yaeyocayieaiion peedicied ihaiHILPDA is mosiyy disieibuied in ihenucyeusand miiochondeia.Immunooyuoeescenceco-yocayieaiion anayysisconoiemed ihaiHILPDAhad ahighee eepee s ion in ihenucyeusand ihemiiochondeiaooeascuyaesmooih muscyece y s;peoiein-peoiein inieeaciion(PPI)neiwoek anayysis conoiemed ihaiHILPDA-eeyaied peoieinsaeeeeyaied ioce u yaeeesponiohypoeiaand yipid deopyei.HILPDA peoiein eepee s ion was significanUy higher in the AAA tissues than the peritumor arteriai tissues(control group)+(47.2±5.6)%o (7I.5±4.7)%,"<0.0I]. Conclusion HILPDA gene might have potential guiding value in the clinical studies concerning the diagnosis and treatment of diabetes accompanied wiih AAA.
)Key words]diabetes mellitus,type2;abdominal aortic aneuysm；hypoxia-inducible lipid droplet-associated
This work wn supported by the National Nat/ral Scienco Foundatioo o China(8I7004I6).
Correspofding author:MA Dong,
收稿日期：2020-09-12；接受日期：2020-10-21
舞彩浅山基金项目：国家自然科学基金(81700416)
通信作者：马冬,E-mail:mamamadong@163-com
糖尿病是全身性代谢紊乱性疾病，影响糖类、蛋白质和脂质代谢，导致脂代谢紊乱和高脂血症，从而造成各器官微血管和大血管的损害，并以此为基础造成各种慢性并发症［I,2］%有研究表明2型糖尿病是腹主动脉瘤(abdominal aoOie aneuysm,AAA)的保护性因素［3,4］，但动脉粥样硬化病变和心血管疾病的高发病率是糖尿病患者死亡的主要原因⑸，因此,2型糖尿病患者早期预防、诊断、治疗对于心血管疾病的预防和治疗具有重要意义％
缺氧诱导脂滴相关蛋白(hypoxiaQnducible lipid dsplet-assvciated,HILPDA)是过氧化物酶体增殖物激活受体(peroxisome psliferators-activated ep-tors,PPARs)的靶点，参与甘油三酯的分泌，调节肝脏脂肪代谢［6］%HICPDA在早期动脉粥样硬化中通过增加斑块脂质来促进病变的形成，HILPDA介导的脂滴影响着动脉粥样硬化的自然史+7］，动脉粥样硬化与腹主动脉瘤的发生相关，但在2型糖尿病
及糖尿病血管病方面未见报道％本研究通过生物信息学预测分析和实验验证发现,2型糖尿病合并AAA 患者血液和血管组织中HICPDA表达均明显上调，提示血糖调节紊乱引起该基因表达上调后进一步加质代谢，造成缺质，促进病
管病发生的可能机制％
1材料与方法
1.1材料
人主动脉平滑肌细胞株(human yoOie smooth muscla cells,HASMC,ScienCel l,nv.6110，美国细胞科学公司)、线粒体红色(mitotrackerxed)荧光探针(上海碧云天生物技术有限公司)、4%多聚甲醛溶液(北京雷根生物有限公司)、10%山羊血清(上海碧云天生物技术有限公司，C0265)、antCHILPDA抗体(上海玉博生物科技有限公司)、异硫氧酸荧光素(fluorescain isothiveyanaia,FITC)标记荧光二抗(赛默飞世尔科技有限公司)、含细胞核特异性染色剂4,6-二眯基-2-苯基MN(4f6-diamidinv-2-phenylindola,DAPI，上海西格玛奥德里奇有限公司)％
1.2方法
1-2.1差异表达基因筛选在美国国家生物技术信息中心(National Centar far Biotechnologa Infoeny-tion,
NCBI)网站Gene Expression Omnibus(GEO)数据库"htt y s：//bb nlm-nih-gav/gev/)分别检索2型糖尿病、AAA相关数据集，获得GSE21321和GSE7084数据集％GSE21321数据集样本为2型糖尿病患者(n=158)及正常人的血液样本(n=158)；GSE7084数据集中腹主动脉(n=7，男性3例)和AAA组织样本(n=12，男性8例)分别是在死亡24h内(对照组)和手术解剖(动脉瘤组)获得的%利用GEO2R在线工具对GSE21321和GSE7084数据集进行差异基因分析，筛选共表达变化的基因%病例组与对照组之间差异表达的基因由中科新生命云平台生成火山图直观展现，火山图的横坐标为每个基因差异倍数(fold changa,FC)的对数值，纵坐标为相应基因"值取10的对数后的负值，红色和绿色的点分别代表上调和下调的基因，黑色则代表在病例组和对照组中表达差异不甚明显的基因％
1.2.2亚细胞定位预测通过NCBI的Protein数据库"htt p s：//bb nlm.nih.gvv/protein)检索HICPDA，得到HICPDA蛋白氨基酸FASTA序列％将HLPDA蛋白FASTA序列输入Genscyt数据库(https：//scOpC com/tools/psoO)及predici-peoiein台(h i ps：jjwww peedicipeoiein oeg)进行蛋细胞定分析%
1-2-3荧光染色共定位检测HICPDA蛋白在细胞核与线粒体中的定位人血管平滑肌细胞爬片，将mitotrxeker-red加入培养基中30min后取出小片并用多聚甲醛固定，10%山羊血清封闭，anC-HILPDA 抗体孵育结合3702h，加异硫氧酸荧光素"fluorescein isothiveyanata,FITC)标记荧光二抗孵育结合45min，采用含细胞核特异性染色剂DAPI的封片剂封片，随后进行激光共聚焦成像拍照并分析蛋白表
定%
1-2.4STRING数据库分析HICPDA蛋白相互作用网络分析HICPDA及其相关蛋白在糖尿病血管病发展形成过程的可能机制，使用STRING(arch tool far tha retCval of interacting yenas)数据库(/)进行蛋白互作分析，设置置信度为0.4,—级相关蛋白数量＜10,6级相关蛋白数量＜10，构建HILPDA蛋白相互作用网络并进行GO KEGG分析，到HILPDA蛋互作用 及其与相关蛋白GO和KEGG富集分析％蛋白质相互作用网络中的节点表示蛋白质，线段表示交互作用％
1-2.5免疫组织化学法检测糖尿病合并AAA膜组织中HICPDA的表达血管组织石蜡切片4&m，免疫组织化学(immunohistochemistry,IHC)染色采用链霉菌亲和素-过氧化物酶连结法(streptavidinperoxida conjugated method,S-P)按说明书进行。随机选取5个视野，通过Imaye-Pra Plus6-0软件(美国MEDIN CYBERNETIC 图像技术公司)分析棕
颗粒在整个视
所占的百分比。一抗采用兔抗人抗体 HIPPDA " PAB20497, Abnova ） %1.3统计学处理
采用SPSS 13.0软件进行数据分析，计量资料以
均数土标准差（土+表，各指标间比较采用重复测量
设计的方差分析％ "<0.05为差异有统计学意义％
2结果
2.1差异表达基因筛选
GEO2R 分析 到的全部差异基因以"< 0. 05 & I logFC I > 1为标准筛选到2型糖尿病和AAA
的差异基因分别为2405&1314 % GEO2R 分析结
果显示HIPPDA 基因在2型糖尿病中上调11. 35 倍,AAA 中上调6.4倍，且其部分相关蛋白也有显
著差异％ 2型糖尿病与AAA 差异基因火山 见
1%图A 为2型
病差异基因火山图；图B 为
AAA 差异基因火山图％ 为显著 基
因，绿 为显著 基因，黑 为无显著差异基因；绿标记基因为显著上调标记基因，红
标记基因为显著 标记基因，蓝 标记基因
为无显著差异基因%
2.2
定位分析及荧光共定位
为了解该基因所表达蛋白质的分布情况，了 解该蛋白的功能，对其进行亚细胞定位预测分析
及荧光共定位实验％亚细胞定位结 见图2%A 为GencOpi 数据库预测结果；图B 为激光
共聚焦显微镜共定位观察
肌细胞中
HIPPDA 蛋
细胞 线粒体中的定位情况%
Gencript 数据库显示HIPPDA 蛋白的细胞定位为:
细胞核中占30.4%，线粒体中占26. 1%，胞质中占
13.0%，高尔基体中占8.7%，细胞外（包括细胞
壁）占 8. 7%，其余部位占 13.1% ； predietprotein 平
台显 蛋白为分泌蛋白，预测可信度为73%进
行荧光标记的HIPPDA 抗体呈现出绿色荧光，细
胞 DAPI 染色后呈现出蓝色荧光，线粒体经
MiOWackarf
呈现红色荧光％分析结果表明
基因为分泌蛋 ， 细胞 线粒体中有
的表达，表明其与 基因的 及细胞的能量
代谢相关％
2.3 皿PDA 蛋白相互作用网络及基因本论（GO ）、
京都基因和基因组数据库（KEGG ）富集分析
为进一步研究HIPPDA 基因影响糖尿病和
AAA 的作用机制，将该基因名称输入STRING 数据
库，得到HILPDA 蛋 互作用 ，详见图3% I
与细胞对缺氧的反应相关；蓝 与调节
细胞代谢过程相关；绿 与脂质滴相关％基因
本论（gena ontologe ，GO $和京都基因和基因组数据
库（Kyoto encyclopedio of genas and genomas ，KEGG $
富集分析表明，HIPPDA 表
要参与缺氧诱导的
RNA 聚合酶#启动子
的调控、细胞对缺氧应激
的反应和能量代谢（甘油三酸酯分解代谢、脂解的 调节）等方面的
学功能（表1$%
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o.log 2 (Trail making test / Control )A p o ot
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学生自评50字
7.5.2
O
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-
4 0 4
log 2 (Trail making test / Control )
B
• A
Up
Down Not
图1 2 尿病与AAA 差异基因火山图
Figure 1 Volcano maps of dhferent genes between type 2 diabetes mel/tus and abdominal aortic aneuysm
A : volcanO map of dihemnUal genes in type 2 diabetes mel/tus (T2DM group , n - 158； control group , n - 158 $ ；
B : volcanO map of dhemnUal
genes in abdominal ao —ic aneuysm ( AAA group , n - 12 ； control group , n =7$ - The absciss a reprents the difference multiple (log 2 value $ of the dihemnUat gene , and the ordinate reprents the " value (一/ value $ - Red node is significanUy up-regulated gene ； green node is significantly down-eeguyaied gene ； byack nodeino3ignificanidi f eeencegene.Geeen maekeegenei3ignificaniyyup-eeguyaied maekeegene ； eed maekeegenei七月再见八月你好
significanUy down-regulated marker gene ； blue marker gene is no significant dihemnce gene. AAA : abdominal ao —ic
aneuysm.
■Nucleus■Mitochondria
■Cytoplasm ■Extracellular ■Golgi浪费的意思
■Secretory vesicles
■Endoplasmic reticulum■Other
A
鲜菇
图2HILPDA蛋白的亚细胞定位
Figure2Subcellular locXization of HILPDA protein
A:prediction results of GencOpt databxc；B:localization of HILPDA protein in nucleus and mitochondria of vascular smooC muscle cells obrved under lar confocal microscope-Blue reprents DAPI staining nucleus；red reprents mitochondriP dye mimWacker；gn reprents HILPDA antibody-HILPDA:hypoxia-inducible lipid droplet-associated;DAPI:4*,6-diamidino-2-phenylindoie-Scale bar-50&m-
LFP
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PLIN2、WNT3A HILPDA
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图3HILPDA蛋白相互作用网络图及富集分析Figure3HILPDA protein interaction network diagram and
enrichment analysis
Red node is related to Ce cell respon to hypoxia;blue node is related to iheeeguyaiion ooce y meiaboyim；geeen nodeieeyaied ioyipid deopyei.
HILPDA:hypoxia-inducible lipid droplet-associated.
2.4HILPDA在糖尿病合并AAA组织中的表达
免疫组织化学法检测8例人糖尿病合并AAA 及其相应的瘤旁对照(control)组织，结果进一步证实了在糖尿病合并AAA组织中HILPDA的蛋白表达上调更为显著［(71.5±4.7)%和(47.2±5.6)%, "=0.005；图4］o
3讨论
AAA是老年人致死性疾病，主要表现为主动脉的病理性膨出破裂。以往研究表明，2型糖尿病患者AAA的发病率明显升高［8,9］O有2型病患者AAA的发病进缓慢，提2型糖病是AAA的因素+I0,II］，但了AAA累及肾动脉或骼动脉，进而损伤肾功能和影响外科手术和介入治疗，且治疗费用也会相应增加。因此，探讨糖尿病因素对AAA病理进展的作用机制具有临床现实意义。
本研究应用生物信息学技术发现2型糖尿病和AAA患者的血液和组织中HILPDA均明显上调。有研究表明HICPDA基因细胞脂质代谢+12-4］、细胞对缺氧的反应［I5］，且HICPDA在早期动脉粥样中通过斑块脂质来促进病变的形成, HICPDA介导的脂滴影响粥样的自然史［7］%推测2型糖尿病导致HILPDA上调，该基因进一步质代谢导致缺的累，造成糖尿病血管病的发生
％
表1HILPDA及其相关基因的GO富集及KEGG通路分析雅威
Table1GO enrichment and KEGG pathway analysis
oeHILPDAand sieyaied genes
Faye Item Descespison Couni
discoeeeaeaie GO-ieem
Biological process
0061418Regulation of transcription from RNA polymera#promoter in respon to hypoxia5 4.66e-07 0071456Cellular respon to hypoxia6 4.73e-06 %%0019433Triglyceride catabolic process30.00044 %%0031325Positive regulation of cellular metabolic process120.0015
%%0010883Regulation of lipid storage30.0015
%%0010891Negative regulation of questeOng of tuglyceOde20.0018
%%0043687Post-translational protein modhicaXon50.0027
%%0036155Acygyceeo;acy-chasn eemodesng20.0027 Molecular function
0005109Frizzled binding30.0012
%%0052689Carboxylic ester hydrola activity30.0139
%%0035035Hisioneaceiyieansfeeabinding20.0139
%%0016411AcaygyceeoyO-acayieansfeeaaciieii20.0139
%%0016298Lipaaciieii30.0139 Cellular component
0005811Lipid deopyei5 2.27e-06 KEGGpaihway
%%hsa05200Paihwaasin cancee8 1.36e-06 %%hsa04923Reguyaiion ofyipoysisin adipocaies4 6.88e-06 %%hsa05217Basayce y caecinoma48.83e-06 %%hsa05211Renayce y caecinoma48.86e-06 %%hsa05205Peoieogycansin cancee5 1.39e-05 HILPDA:hypoxia-inducible lipid droplet-associated;GO:gene ontologe;KEGG：kyoto encyclopedia of genes and genomes;e-07：10Y；e-06：10Y；e-05：10Y-
图4IHC检测人糖尿病合并AAA和相应的瘤旁组织中HILPDA的表达
Figure4HILPDA expression in human diabetes mel/tus complicated with AAA and
corresponding aneuysmai tissues detected by IHC
IHC:immunohistochemistry；AAA:abdominal ao—ic aneuysm；HIPPPA:hypoxiv-inducible lipid dyplet-associated-
Compared with control group,*"<0-001-Scale bar-50&m
通过Genclpi数据库亚细胞定位预测到HILPDA 所表达蛋要分布在细胞线粒体，胞质、基体、囊泡、内质中定，是一分泌蛋，且通过荧光共定位证实该基因在细胞核及线粒体中有的蛋白表达，表明HIPPDA通过对下游基因的参与细胞能量代谢，这需要进一步研究证实。
通过蛋白间相互作用分析发现，HILPDA 及其相关蛋白与能量代谢及脂质代谢相关,GO和KEGG分析表明，HIPPDA基因表要富集于缺应中RNA聚合酶#启动子的、细胞对缺氧的反应和能量代谢（脂质成、甘油三酸酯
