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收稿日期：2020-12-16基金项目：国家留学基金项目（201808420365）；教育部产学合作协同育人项目（202102102111）；湖北省教育厅科学研究计划项目
（B2017076）
第一作者：谢佳燕（1974-），/0000-0001-5749-7642，博士，副教授，主要从事昆虫毒理与分子生态学研究工作，
基于Rag1基因序列的黄河高原鳅群体
遗传结构分析
谢佳燕，颜
渊，杨钰慧，闫达中，吴菁
（武汉轻工大学生命科学与技术学院，武汉
430023）
摘要：【目的】明确不同水域黄河高原鳅群体免疫基因多样性水平和遗传组成，为黄河高原鳅自然种质资源现状的评估、保护及合理开发提供理论依据。【方法】采集黄河中上游不同河段的黄河高原鳅自然群体［青海循化（XH ）群体、青海大通（DT ）群体及甘肃景泰（JT ）群体］样品，基于重组激活基因（Rag1）序列对不同黄河高原鳅群体的遗传多样性水平和遗传组成差异进行研究。【结果】在不同黄河高原鳅群体的Rag1基因序列中共检测到8个单倍型（H1~H8），其中有5个单倍型（H1、H2、H3、H4和H6）在2个以上的群体间相互共享，尤其是单倍型H1、H4和H6在所有群体中均有分布。黄河高原鳅总群体的单倍型多态性为0.742，核苷酸多态性为0.003，在3个黄河高原鳅群体中共检测到28个多态位点。不同黄河高原鳅种群间的单倍型多态性范围在0.575~0.872，核苷酸多态性范围在0.002~0.003。XH 群体与JT 群体间的遗传分化系数（F st ）为0.037，XH 群体与DT 群体间的F st 为-0.041，JT 群体与DT 群体的F st 为-0.022；不同黄河高原鳅群体的分子遗传变异主要发生在群体内（占99.56%）。单倍型网络结构图及NJ 聚类树和ML 聚类树均显示，不同黄河高原鳅自然种群个体相互混合在一起，未按照采样河段地理位置形成明显的聚类结构，即黄河高原鳅不同单倍型间呈现混合的分布格局。【结论】黄河高原鳅群体遗传多样性水平中等，不同自然群体间的遗传多样性水平存在一定差异，但并未检测到显著的遗传差异，建议在野外进行管理和保护时仍可视为一个整体。
关键词：黄河高原鳅；Rag1基因；自然种群；遗传结构；单倍型中图分类号：S965.199
文献标志码：A
文章编号：2095-1191（2021）12-3237-07
Genetic structure of Triplophysa pappenheimi populations
bad on Rag1gene quence
XIE Jia-yan ，YAN Yuan ，YANG Yu-hui ，YAN Da-zhong ，WU Jing
（School of Life Science and Technology ，Wuhan Polytechnic University ，Wuhan 430023，China ）
Abstract ：【Objective 】Studying the population immune gene diversity and genetic structure could effectively asss
the current status ，and provide a theoretical basis for conrvation and rational exploitation of the wild resources of Triplo-physa pappenheimi .【Method 】The genetic diversity and structure of the natural populations of T.pappenheimi ，sampled from different reaches of the middle and upper reaches of the Yellow River ，Xunhua （XH ）and Datong （DT ）in Qinghai Province ，and Jingtai （JT ）in Gansu Province ，were analyzed by using the recombination activating gene 1（Rag1）-quences.【Result 】Eight unique haplotypes （H1-H8）were identified in Rag1quen
ce from all individuals of T.pappen-heimi .Five haplotypes （H1，H2，H3，H4and H6）shared between any two of populations ，and three of them （H1，H4and H6）shared among all populations.The haplotype and nucleotide diversities of T.pappenheimi were 0.742and 0.003，respectively.Twenty eight polymorphic sites were detected in three populations.Haplotype diversity ranged from 0.575to 0.872and nucleotide diversity ranged from 0.002to 0.003among populations.The genetic differentiation coefficient （F st ）value between XH and JT ，between XH and DT ，and between JT and DT were 0.037，-0.041，and -0.022，respectively.The molecular variation analysis （AMOV A ）revealed high genetic variation within populations （99.56%）.Both NJ and ML phylogenetic tree and haplotype network analysis showed that individuals from different populations were mixed to-gether and did not form obvious cluster according to phylogeographic structure.Mixed distribution patterns were pren-
52卷
南方农业学报
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0引言
【研究意义】高原鳅属（Triplophysa）隶属于鲤形目（Cypriniformes）条鳅科（Nemacheilinae），是适应于高原高寒及高海拔环境的青藏高原主体鱼类群体（陈宜瑜，1998）。高原鳅属鱼类是鲤形目中物种最丰富的属，目前记录有近150个有效种，我国分布有126个种（He et al.，2020），主要分布在青藏高原及其邻近地区的河流或湖泊。高原鱼类的起源及演化与青藏高原形成过程中导致周边气候环境的激烈演变密切相关（何德奎等，2006；He et al.，2016；Feng et al.，2019）。因此，系统开展高原鳅属鱼类的进化及其适应性研究，对挖掘高原生物多样性的起源问题具有重要意义。【前人研究进展】黄河为我国的第二大河流，分布有淡水鱼类物种165种（He et al.，2020），其上游鱼类区系以高原鱼类为主（陈宜瑜，1998）。然而，随着人类活动的加剧及外来物种的快速入侵等，致使水体生态环境日益遭到破坏，黄河上游鱼类生物多样性正面临着持续丧失的威胁，许多鱼类资源逐渐衰竭，且濒危程度和范围不断加剧（茹辉军等，2010；Xie et al.，2018）。黄河高原鳅［T.pappen-heimi（Fang，1935）］是高原鳅属中体型较大的条鳅科物种，主要分布在兰州以上黄河上游的干支流激流河段及其附属湖泊，是适应于高原季节极端性寒冷环境的代表性鱼类种群之一（朱松泉，1989）。目前，黄河高原鳅已被列入《中国脊椎动物红色名录》，属于濒危鱼类（Endangered，EN）（曹亮等，2016；蒋志刚等，2016），已陆续在黄河上中游设立3个国家级自然保护区及3个国家级水产种质资源保护区，重点保护包括黄河高原鳅在内的黄河上游特有鱼类（水利部黄河水利委员会，2007）；同时在龙羊峡下游建设有2个鱼类增殖站，对黄河特有鱼类物种种群数量的维持和增长具有重要意义（洪欢，2016）。移植驯化、人工繁育和增殖放流等是进行种质资源保护的重要措施，但人工增殖放流物种或个体是否对自然种群的遗传结构产生影响，进而导致不同地理种群遗传
结构同质化，是种群补充过程中必须密切关注的问题。因此，在人工增殖放流前对自然种群遗传多样性及其遗传结构进行深入研究，有助于指导选择人工繁殖亲鱼来源和放流河段，评估增殖放流对物种或种群遗传多样性的影响，提高对濒危物种的有效保护效果（杨君兴等，2013）。重组激活基因（Re-combination activating genes，RAGs）普遍存在于脊椎动物的核基因组中，是脊椎动物受异原物质刺激后进行特异性免疫响应的主要基因（Schatz et al.，1989），现已发展成为研究动物遗传进化和遗传多样性的典型核基因分子标记（Yu et al.，2014；Hague and Routman，2016；Silva-Santos et al.，2018）。方冬冬等（2018）基于Rag2基因探讨淮河源区（Hemiculter leucisculus）种群遗传多样性及其群体遗传结构，发现由于近期群体扩张和频繁的基因交流，导致淮河源区群体间尚未形成明显的遗传结构和谱系格局。Eldridge等（2018）基于Rag1基因评估苏拉威西岛特有鼩鼱（Crocidura elongata）的遗传结构组成，结果发现该地区的鼩鼱种群具有较高的遗传多样性，其多样性结构的形成与特有地区领域边界、海拔高度及领域内的地理隔离有关。Wu等（2019）基于Rag1基因分析香港异鱲（Parazacco spi-lurus）的遗传结构，发现相邻水域中具有2个高度分歧的谱系，且谱系间的分歧超过了鲤科近缘属间的物种分化，即这2个谱系可能代表2个不同的物种。【本研究切入点】至今，有关黄河高原鳅的研究主要涉及其物种订正及系统发育进化分析等领域（何德奎等，2006；Wang et al.，2016；Li et al.，2017；Feng et al.，2019），而针对其自然种群遗传多样性水平和遗传结构分析的研究鲜见报道。【拟解决的关键问题】采集黄河中上游不同河段的黄河高原鳅自然群体样品，通过测定其Rag1基因序列，分析不同河段黄河高原鳅群体免疫基因多样性水平和遗传组成，以期为黄河高原鳅自然种质资源现状的评估、保护及合理开发提供理论依据。
ted between the different haplotypes in T.pappenheimi.【Conclusion】It is suggested that the natural populations of T. pappenheimi have the middle level of genetic diversity.Different levels of genetic diversity are found among the wild populations.Moreover，it is not obviously identified genetic divergence among the populations of T.pappenheimi.It is suggested that management and conrvation of the populations in the field can be regarded as a whole.
Key words：Triplophysa pappenheimi；Rag1gene；wild population；genetic structure；haplotype
Foundation item：State Foundation for Studying Abroad（201808420365）；Collaborative Education Project of In-dustry University Cooperation of the Ministry of Education（202102102111）；Scientific Rearch Project of Education Department of Hubei（B2017076）
12期·3239·
1材料与方法
1.1样本采集
黄河高原鳅样本分别采自黄河流域的青海和甘肃河段，共3个群体［青海循化（XH）群体、青海大通（DT）群体及甘肃景泰（JT）群体］。收集黄河高原鳅个体的新鲜肌肉样品置于95%乙醇中固定，-2
0℃保存备用。
1.2黄河高原鳅Rag1基因克隆及测序分析
采用标准酚—氯仿法提取黄河高原鳅基因组DNA，然后参照Li和Ortí（2007）的方法，利用引物RAG1-2510F和RAG1-4063R扩增黄河高原鳅Rag1基因序列。PCR扩增体系50.0μL：10×PCR扩增缓冲液5.0μL，dNTP（200μmol/L）1.0μL，上、下游引物（0.15μmol/L）各0.75μL，DNA模板1.0μL，Taq DNA聚合酶0.6μL，三蒸水补足至50.0μL。扩增程序：94℃预变性3min；94℃50s，52℃1min，72℃90s，进行35个循环；72℃延伸10min，4℃结束反应。PCR扩增产物经纯化回收后，送至武汉艾康健生物科技有限公司进行测序。
1.3数据分析
采用ClustalX1.83和SeaView分别对黄河高原鳅Rag1基因序列进行比对分析（Thompson et al.，1997）；利用DnaSP v5进行单倍型识别（Librado and Rozas，2009）；运用Arlequin3.5程序包完成群体遗传多样性、遗传距离和基因流计算及分子变异方差分析（Analysis of molecular variance，AMOV A）（Excof-fier and Lischer，2010）；采用Network10.1以Median-joining法构建不同黄河高原鳅单倍型间的网络结构图（Bandelt et al.，1999）。从GenBank下载条鳅科北方须鳅（Barbatula barbatula，EU711107）、背纹南鳅（Schistura balteata，EU711131）及长尾软鳍条鳅（Paracobitis
longicauda，EU711124）的Rag基因序列，并与黄河高原鳅Rag1基因序列进行多序列比对
分析；基于Kimura’s2-parameter模型，采用MEGA 6.0构建黄河高原鳅不同单倍型的NJ（Neighbor-joining）聚类树和ML（Maximum-likelihood）聚类树（Tamura et al.，2013），其置信度采用Bootstrap为1000次进行重复检验。
2结果与分析
2.1黄河高原鳅Rag1基因的核苷酸组成特点
对黄河高原鳅样本的Rag1基因序列进行比对分析，结果获得Rag1基因外显子长度为1485bp的同源序列。在3个黄河高原鳅群体45个样本中共检测到28个多态性位点（表1），包括16个碱基转换位点和12个碱基颠换位点；Rag1基因序列中无碱基插入或缺失现象。黄河高原鳅Rag1基因序列中碱基A、T、G和C的含量无明显差异，分别为24.8%、22.7%、28.1%和24.4%。
2.2黄河高原鳅单倍型及群体遗传多样性
对黄河高原鳅Rag1基因进行PCR扩增，经1.0%琼脂糖凝胶电泳检测，均获得清晰单一的目的基因条带（图1），测序后进行比对分析共识别到8个Rag1基因序列单倍型（表2），其中，有3个单倍型（H5、H7和H8）为单个种群所特有（占11.6%），其余5个单倍型出现在黄河高原鳅的不同种群中。
单倍型H1、H4和H6在所有黄河高原鳅群体中均有分布，占76.7%，且单倍型H6的数目占总个体数的46.5%。由单倍型网络结构图（图2）可看出，除单倍型H8外，黄河高原鳅Rag1基因的所有单倍型均以单倍型H3为中心和起点，呈星状分布态势或进化形成新的不同分支。黄河高原鳅Rag1基因不同单倍型间的变异步数分别为1~4步，表明黄河高原鳅各单倍型并未依据采样河段的地理位置而形成独立分支。
对黄河高原鳅不同群体Rag1基因的遗传多样性水平进行检测，结果表明，黄河高原鳅总群体的单倍型多态性为0.742，核苷酸多态性为0.003。不同黄
单倍型Haplotype H1
H2
H3
H4
H5
H6
H7
H8
多态性位点Polymorphic site
2
2
5
G
.
.
.
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A
.
2
7
8
A
C
.
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.
C
C
.
7
7
6
T
.
.
A
.
.
.
.
9
2
3
T
.
.
C
.
.
.
C
9
7
7
G
.
A
.
A
A
A
.
9
8
T
.
.
.吃的笔画顺序
.
.
.
C
1
1
A不挑食教案
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.
.
.
.
.
G
1
1
6
C
.
.
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G
1
1
9
C
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.
.
.
.
G
1
2
好心办坏事的例子
6
T
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.
.
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.
.
A
1
3
1
C
.
.
.
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A
1
3
8
C
.
.
.
.
.
.
A
1
6
4
C
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.
.
.
T
1
7
C
.
.
.
T
T
T
.
1
8
5
T
.
.
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.
C
1
1
1
2
G
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.
.
C
1
1
2
1
T
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.
.
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.
.
A
1
1
3
A
.
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.
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.
.
G
1
1打开控制面板
4
2
T
.
.
.
.
C
C
C
1
2
2
T
.
.
.名人故事作文
.
.
.
C
1
2
3
2
T
.
.
.
.
.
.
A
1
2
3
5
A
.
.
.
.
.
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G
1
2
5
3
A
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.
.
.
.
.
C
1
3
3
7
T
.
.
C
.
.
.
C
1
3
7
6
T
.
.
C
.
.
.
C
1
3
8
8
T
.
.
.
.
.
.
G
1
4
1
8
C
关于酒的诗.
.
.
.
.
.
T
1
4
8
1
C
.
.
.
.
.
.
T
表1黄河高原鳅Rag1基因序列的碱基多态性位点
Table1Polymorphic ba sites of quences for recombination activating gene1（Rag1）of T.pappenheimi
谢佳燕等：基于Rag1基因序列的黄河高原鳅群体遗传结构分析
52卷
南方农业学报·3240·裁员方案
河高原鳅群体的遗传多样性呈中等水平，其种群间的单倍型多态性范围在0.575~0.872，核苷酸多态性范围在0.002~0.003（表2）。其中，JT 群体的单倍型多态性明显高于其余2个黄河高原鳅群体，但其核苷酸多态性在不同群体中基本相似。2.3黄河高原鳅群体遗传结构
运用Arlequin 3.5程序包对不同黄河高原鳅群体进行群体遗传多样性分析，结果表明，XH 群体与JT 群体间的遗传分化系数（F st ）为0.037，XH 群体与DT 群体间的F st 为-0.041，JT 群体与DT 群体的F st 为-0.022。经Global test 检测发现，仅JT 群体和DT 群体间存在显著差异（P <0.05）。对不同黄河高原鳅群体间的基因流进行分析，结果发现整个自然群体的基因流为17.79。AMOV A 分析结果也表明，不同黄河高原鳅群体的分子遗传变异主要发生在群体内，占99.56%。
2.4黄河高原鳅单倍型聚类分析结果
基于Kimura ’s 2-parameter 模型，以北方须鳅（EU711107）、背纹南鳅（EU711131）及长尾软鳍条鳅（EU711124）的Rag 基因序列为外群，构建不同黄河高原鳅群体Rag1基因单倍型的NJ 聚类树和ML 聚类树，结果显示构建获得的NJ 聚类树（图3）和ML 聚类
树（图4）基本一致，黄河高原鳅与北方须鳅、背纹南鳅及长尾软鳍条鳅的亲缘关系均较远。不论是在NJ 聚类树还是在ML 聚类树中，3个黄河高原鳅群体的8个单倍型均先聚类成独立分支，然后与北方须鳅聚类成一支，而背纹南鳅与长尾软鳍条鳅聚类成另一分支。黄河高原鳅不同单倍型间呈现混合的
分布格局，其中单倍型H8在NJ 聚类树和ML 聚类树中均位于所有高原鳅单倍型分支的最底部，且未发现黄河高原鳅单倍型与采样地点对应的分支，与单倍型的网络结构图相似。
3讨论
物种个体间的遗传多态性能为其适应环境改变的生命进化过程提供主要的多态性来源，可同时反映并影响物种、群落及生态系统等更高组织水平
指标Index 样本量（尾）Sample size （ind ）单倍型（个）Number of haplotypes （haplotype ）多态位点（个）Number of polymorphic sites （site ）单倍型多态性Haplotype diversity 核苷酸多态性Nucleotide diversity
XH 群体XH population
1458
0.670±0.1260.002±0.001
JT 群体JT population
1579
0.872±0.0670.003±0.002
DT 群体DT population
16427
0.575±0.1150.003±0.002
图1黄河高原鳅Rag1基因PCR 扩增电泳结果
Fig.1Agaro gel electrophoresis for PCR amplification of
Rag1gene of T.pappenheimi
M ：DL3000DNA Marker ；1~5：黄河高原鳅样本M ：DL3000DNA Marker ；1-5：Samples of T.pappenheimi
表2不同黄河高原鳅种群的单倍型多态性和核苷酸多态性
Table 2Haplotype diversity and nucleotide diversity of populations of T.pappenheimi
图2不同黄河高原鳅种群单倍型网络结构图
Fig.2Haplotype network diagram of different geographic po-pulations of T.pappenheimi
H1~H8：黄河高原鳅群体单倍型。圆图面积表示单倍型频率；黄色表示XH 群体，绿色表示JT 群体，蓝色表示DT 群体；空白圆圈表示缺失的单倍型H1-H8：Haplotype of T.pappenheimi population.The areas of the cir-cles was proportional to haplotype frequency.Yellow reprented XH population,green reprented JT population,and blue reprented DT population.Open dots reprented missing
haplotypes
M
1
2
3
4
5
3000bp 2000bp
1000bp 500bp 250bp 100bp
750
bp 1485bp
12期
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的多态性过程（Frankham ，2005），因此，遗传多样性也被认为是监测生物圈完整性所必需、最基本的生物多样性变量（Steffen et al.，2015）。种内遗传多样性的保持有助于物种繁衍和维持整个生态系统多样性，而遗传均质化或多样性贫乏将威胁物种或群体的持续生存（Frankham ，2005）。单倍型多样性和核苷酸多样性是评价遗传多样性水平的2个重要参数，其阈值分别为0.5和0.005（Grant and Bowen ，1998）。本研究基于Rag1基因序列对黄河高原鳅群体样本进行遗传多样性分析，结果表明，黄河高原鳅总群体的单倍型多态性为0.742，核苷酸多态性为0.003，其遗传多样性水平并不高，可能与近年来黄河流域生境遭到破坏、水体污染严重及过度捕捞等因素致使天然水域中黄河高原鳅资源严重衰退有关（茹辉军等，2010；唐文家和何德奎，2013）。在自然水体中黄河高原鳅种群已
萎缩或呈破碎化，种群数量极速下降，
而改善黄河高原鳅的生境是维持其种群遗传多样性高水平的有效措施。
虽然在天然水域中黄河高原鳅种群数量萎缩明显，但本研究的AMOV A 分析结果表明黄河高原鳅的分子遗传变异主要来自群体内（占99.56%），群体间的F st 为-0.041~0.037，仅JT 群体与DT 群体间存在显著差异；黄河高原鳅不同单倍型间呈现混合的分布格局，群体间共享单倍型所占比例较高（88.4%），不同高原鳅群体间仍保持一定的基因交流。栖息地流域上中游间的相互连通，也可能促进水系流域上下游不同高原鳅群体间的相互交流，进而削弱因地理隔离导致的群体间差异，致使不同黄河高原鳅群体间未检测到明显的单倍型地理分布格局。近年来，黄河干支流上已完成多处梯级水利设施的大规
图3黄河高原鳅不同单倍型的NJ （Neighbor-joining ）聚类树
Fig.3
Neighbor-joining phylogenetic tree of Rag1gene haplotypes of T.pappenheimi
图4黄河高原鳅不同单倍型的ML （Maximum-likelihood ）聚类树
Fig.4
Maximum-likelihood phylogenetic tree of Rag1gene haplotypes of T.pappenheimi
黄河高原鳅简短的生日祝福语
T.pappenheimi
黄河高原鳅
T.pappenheimi
北方须鳅（EU711107）B.barbatula
背纹南鳅（EU711131）S.balteata
长尾软鳍条鳅（EU711124）P .longicauda
北方须鳅（EU711107）B.barbatula
背纹南鳅（EU711131）S.balteata
长尾软鳍条鳅（EU711124）P .longicauda
H6H7H5H3H1H2
H4H8
100
100
0.006
H6H7H5H3H1H2H4
H8
1
1
0.007
谢佳燕等：基于Rag1基因序列的黄河高原鳅群体遗传结构分析
