2.1.1酵母双杂交
2.1.1.1Gateway入门克隆
设计Gateway引物时，在上游引物的5'端加上B1序列：GGGG-ACA-AGT-TTG-TAC -AAA-AAA-GCA-GGC-TNN-，下游引物的5'端加上B2序列：GGGG-ACC-ACT-TTG-T AC-AAG-AAA-GCT-GGG-TN-。其中，5'-GGGG序列是保护碱基，防止引物的重要部分被降解，下划线加粗的部分是在整个的Gateway克隆中可以保存下来的序列，3'端的碱基N是为了保证经过入门载体构建目的载体时阅读框的正确性，一般建议为C。
通过PCR扩增获得带有attB位点的基因片段，扩增体系和条件见3.2.2.2，其中将退火温度改为65℃。获得扩增产物后对其进行回收纯化，测定纯化后DNA的质量和浓度后进行下一步的BP反应，反应体系如下：
attB-PCR产物（≥10 ng/μL） | 1-7μL |
pDONR221 (150 ng/μL) | 1μL |
TE buffer, pH 8.0 | 30岁还能长高吗补足8μL |
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将上述混合物加入离心管中，加入2μL BP反应酶，加入之前需将其在涡旋仪上轻轻振荡两次，所有组分混匀离心后，25℃反应1h，加入1μL蛋白酶K后，混匀离心，37℃反应10min终止BP反应，将BP反应产物参照3.2.2.6进行转化，由于pDONR221载体为Kan抗性，所以选用含有50μg/mL Kan抗生素的LB平板进行阳性克隆筛选，参照3.2.2.7检测阳性克隆，然后根据3.2.2.8中的方法提取重组质粒，测定质量和浓度后送至测序公司进行测序。
进行BP反应时，需注意以下几项：
(1)对于BP反应来说，最高效的是采用线性的attB-PCR产物和超螺旋的attP入门载体；
(2)为了提高BP反应的效率，可以将建议的25℃反应1h适当延长至4-6h，可以将效率提高2-3倍，或者延长至过夜反应，可以将效率提高5-10倍，对于长片段克隆来讲，适当的延长反应时间是非常必要的；
(3)提高体系中PCR产物的量可以增加反应效率，但每10μL体系中PCR产物最好不要超过250ng。
2.1.1.2诱饵载体构建
重组的入门载体测序正确后，通过LR反应来构建酵母双杂交的诱饵载体，LR反应体系如下：
入门载体 (50-150 ng) | 1-7μL |
pDEST32 (150 ng/μL) | 1μL |
TE buffer, pH 8.0 | 补足8μL |
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将上述混合物加入离心管中，加入2μL LR反应酶，加入之前需将其在涡旋仪上轻轻振荡两次，所有组分混匀离心后，25℃反应1h，加入1μL蛋白酶K后，混匀离心，37℃白天犯困反应10min终止BP反应，将LR反应产物参照3.2.2.6进行转化，由于pDEST32载体为Gen抗性，所以选用含有50μg/mL Gen抗生素的LB平板进行阳性克隆筛选，参照3.2.2.7检测阳性克隆，然后根据3.2.2.8中的方法提取重组质粒，测定质量和浓度。
LR反应注意事项：对于LR反应来说，最高效的是超螺旋的入门载体和目的载体进行反应，但对于超过10kb的载体，将载体线性化可能反而会提高反应的效率；为了提高LR反应效率，可以适当延长反应时间，这对于大于10kb的质粒非常有必要。
2.1.1.3转化酵母细胞
转化前需小量制备MaV203酵母感受态细胞，步骤如下：
(1)将保存的MaV203菌株在YPAD平板上划线，30℃培养2天；
(2)挑取酵母菌单克隆至10mL YPAD液体培养基中，30℃，230rpm过夜培养；
(3)将过夜的酵母培养液在50mL的YPAD液体培养基中稀释至OD600为0.4左右，30℃，230rpm继续培养2-4h；
(4)室温下2500rpm离心5min收集菌体，弃上清，加入40mL 1×TE（pH7.5）重悬；
(5)室温下2500rpm离心5min收集菌体，弃上清，加入2mL1×LiAc/0.5×TE重悬；
(6)室温静置孵育10min；
(7)立即用于下游的酵母小量转化实验。
酵母感受态细胞制备完成后，按照表3-2中的组合进行转化，通过以下步骤将组合载体转入酵母细胞中：
(1)向每个1.5mL离心管中加入1μg质粒、100μg变性鲑鱼精DNA以及100μL酵母感受态细胞；
(2)加入700μL的1×LiAc/40% PEG-3350/1×炒蚕豆TE并上下颠倒混匀，30℃孵育30min；
(3)加入88μL的DMSO，混匀，然后42℃热击7min；
(4)在微量离心机中瞬时离心10s，弃去上清；
(5)加入1mL1×TE重悬菌体后瞬时离心，弃上清；
(6)加入50-100μL1×TE重悬菌体，然后涂在SC-Leu-Trp平板上，30℃培养2天。
表3-2 酵母转化组合
Table3-2 Sets of plasmids ud in yeast transformation assay
| 教师的图片LEU2 Plasmid | TRP1 Plasmid | Purpo |
1 圣诞快来了 | none | none | Negative transformation control |
2 | pEXP™32/Krev1 | pEXP™22/RalGDS-wt | Strong positive interaction control |
3 | pEXP™32/Krev1 | pEXP™22/RalGDS-m1 | Weak positive interaction control |
4 | pEXP™32/Krev1 | pEXP™22/RalGDS-m2 | Negative interaction control |
5 | pDEST™32 | pDEST™22 | Negative lf-activation control |
6 | Bait plasmid | pDEST™22 | Test of lf-activation |
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2.1.1.4自激活检测
转化完成后，可以进行诱饵载体的自激活检测，同时确定文库筛选时的3AT浓度，具体步骤如下：
(1)从SC-Leu-Trp平板上挑取4个包含重组诱饵载体和pDEST™22载体的单克隆，在一个新的SC-Leu-Trp分别划线，同时，分别挑取表3-2中组合1到5的2个单克隆作为对照，30℃培养18h；
(2)将SC-Leu-Trp作为样板影印至包含不同3AT浓度（0 mM, 10 mM, 25 mM, 50 mM, 75 mM, 和100 mM）的SC-Leu-Trp-His平板上，迅速进行影印清洁2-3次，30℃培养24h；
(3)24h后，再次进行影印清洁2-3次，然后继续放于30℃培养约2天（40-44h）后，进行观察，可以抑制包含重组诱饵载体和空猎物载体的酵母细胞生长的最低3AT浓度即为筛库时所用的3AT浓度，如果这个浓度为100mM，则表明诱饵载体本身存在自激活作用，筛库不能进行，若低于100mM，则筛库可以进行。
2.1.1.5文库筛选
进行文库筛选之前，需将重组诱饵载体按照3.2.4.3中的转化方法转入MaV203中，在SC-Leu平板上筛选阳性克隆。然后进行文库筛选级别的酵母感受态细胞制备，制备过程如下：
(1)接种含有诱饵载体的酵母菌于20 mL SC-Leu培养基中，30℃过夜培养；
(2)翌日早上，将培养液加入300 mL SC-Leu液体培养基中至浓度为2×106 cells/mL (OD600 =~0.10)，30℃继续培养直至培养液浓度达到2×闺蜜日107 cells/mL (OD600 =~0.50)；
(3)室温1000-1500×g离心5分钟收集菌体，30 mL无菌水重悬后转移至50 mL离心管中；
(4)1000-1500×g 室温离心5分钟，弃上清，加入1.5 mL 1×TE/1×LiAc重悬；
(5)立即将感受态细胞用于转化。
将文库转化入酵母感受态细胞的步骤如下：
(1)加1 μg文库DNA和50 μg高质量鲑鱼精DNA至每个1.5 mL离心管中，共加30个管，每个
管里加入50 μL重悬的酵母感受态细胞。注意：文库DNA和鲑鱼精DNA的总体积不能超过20 μL，最好不超过10 μL；
(2)加300 μL除菌的40% PEG-3350/1×LiAc/1昌吉学院是几本×TE 至每个离心管中，翻转离心管充分混合，30℃孵育30min；
(3)加DMSO到10% (~40 μL每管)，然后翻转混匀，42℃热击10min；
(4)从一个转化管中取出100 μL转化液，用灭菌生理盐水按照1:100和1:1000进行稀释，每个稀释倍数涂100 μL至10-cm的SC-Leu-Trp板子上；
(5)将30个管中的转化产物分别涂到30个15-cm含有合适的3AT的SC-Leu-Trp-His平板上，30℃培养3天；
(6)计算10-cm SC-Leu-Trp板子上的克隆数，最好平板上长有20到300个克隆，通过下面的公式计算转化效率：每个转化反应的克隆数=单个平板上的克隆数×稀释倍数×转化总体积/单个平板上涂的菌液体积；
(7)大连有什么好玩的地方对每个SC-Leu-Trp-His+3AT平板进行影印清洁；
(8)30℃继续培养2-3天后，初步筛选出阳性的His+克隆。
2.1.1.6报告基因检测
将SC-Leu-Trp-His+3AT平板上长出来的His+克隆子以及3.2.4.3中的转化组合2-6重培养的新鲜菌落，用无菌水稀释到同一浓度（一个直径1mm菌落加入30μL无菌水中，用血球计数板将所有稀释液调整至同一浓度）。检测HIS3基因和URA3基因表达情况时，将每个菌落稀释液吸取3μL点至SC-Leu-Trp-His+3AT，SC-Leu-Trp-Ura以及SC-Leu-Trp+5FOA（0.2%）平板上，30℃培养3-5天。检测lacZ基因表达情况时，吸取3μL每个菌落的稀释液点至YPAD（覆盖NC膜）平板上，30℃培养2天，准备进行X-gal实验。X-gal实验的步骤如下：
(1)称取10mg X-gal溶解在100μL DMF中，溶解后加入10mL的Z buffer中，同时加入60μL β-巯基乙醇，混匀备用；
(2)将两张直径125-mm的Whatman541滤纸叠放在直径15-cm的培养皿中，用约8mL的上述X-gal溶液完全浸润，并将气泡移除；
(3)用镊子将YPAD平板表面的带有菌落的NC膜轻轻取出，完全浸润在液氮中20-30s，然后将冻过的NC膜轻轻放在上述准备好的滤纸上面，移除气泡，然后轻轻将培养皿中多余的液体倒出；
(4)盖上培养皿的盖子，放置于37℃孵育，孵育时将培养皿倾斜一个很小的角度，从而避免X-gal在滤纸上过多的累积影响实验结果；
