熊脱氧胆酸抑制兔胆结石形成的作用及机制
李月廷1，祝学光1，陈祥柏1，赵昕亮2
(1.北京大学人民医院普通外科，北京 100044;2.北京大学基础医学院生物化学与分子生物学系)
[关键词]熊去氧胆酸/药理学；胆固醇/代谢；氨肽酶N ；胆结石/预防和控制
[摘 要]目的：观察熊脱氧胆酸(UDCA )对新西兰兔胆囊结石形成、肝氨肽酶N (APN )m RNA 水平及胆汁中A PN 活性和总蛋白含量的影响，探讨UDCA 预防胆囊结石形成的机制。方法:(1)动物模型：新西兰兔30只。对照组10只，普通饮食；结石组10只，喂含1.2g ·d -1胆固醇的成石饮食4周;UDCA 组10只，同时喂饲含1.2g ·d -1胆固醇和0.045g ·d -1的U DCA 饮食4周。(2)APN 表达：根据兔AP N 基因cDN A 序列设计引物，提取肝总RNA ，利用RT -PCR 方法，检测肝A PN m RNA 水平的变化。(3)APN 活性：用化学法检测。(4)胆汁中脂类、总蛋白的含量：用生化方法检测。(5)胆固醇饱和指数(CSI )计算：用Carey 表计算。结果：结石组6只(6/10)出现胆囊结石,9只(9/10)出现胆固醇结晶,UDCA 组和对照组无结石及结晶出现；对照组和U DCA 组胆囊胆汁中CSI (对照组0.80±0.09、结石组1.38±0.27及UDCA 组1.18±0.11)、总蛋白浓度(对照组1.25±0.49、结石组4.58±0.93及U DCA 组3.12±0.78)明显低于结石组(P 均小于0.05)，而结石组APN mRN A IOD 比值(对照组0.65±0.18、结石组1.08±0.35及U DCA 组0.72±0.23)、AP N 活性[对照组(6.10±2.53)U ·L -1、结石组(23.64±10.36)U ·L -1及UDCA 组(8.01±2.89)
U ·L -1]明显高于对照组和UDCA 组(P 均小于0.05)。结论：以上结果表明U DCA 主要通过降低肝APN 的表达及酶的活性，抑制APN 的促成石作用而预防胆固醇结石的形成。[中图分类号]R575.62-332 [文献标识码]A [文章编号]1671-167X (2001)05-0469-03
The mechanism of the inhibitory effect of ursodeoxycholate
on gallstone formation in rabbits
L I Yue -Ting 1,ZHU Xue -Guang 1,CHEN Xiang -Bai 1,ZHAO Xin -Liang 2
(1.Department of General Surgery ,Peking U niversity People ′s Hospital ,Beijing 100044,China ;2.Department of Biochemistry and M olecular Biolog y ,Peking University School of Basical M edical Sciences )KEY W ORDS Ursodeo xycholic
acid /pharmacol ;Cholesterol /metab ;APN ;Cholelithiasis /prev
SUMMARY Objective :To explore
the mechanism of the inhibitory effect of ursodeoxycholate (UDCA )
on experimental gallstone formation .Methods :3dietary g roups of New Zealand rabbits w ith 10each w ere allocated as control (normal rabbits chow ),lithogenic (1.2g hig h cholesterol diet )and UDCA prevention (1.2g high cholesterol diet +0.045g ·d -1UDCA )groups respectively for 4w eeks .RT -PCR w as performed for APN gene expression in liver tissue .The enzy matic activity of APN in biles and the concentrations of biliary lipids and protein were analyzed chemically .Gallbladder biles were col -lected for determining the prence of cholesterol crystals and gallstones both micro -and macroscopi -cally and were qualitatively analyzed by infrared spectroscopy .Results :Compared w ith the negative re -sults bo th in control and UDCA preventive groups ,cholesterol cry stals and stones were found in 9and 6out of 10g allbladders respectively in lithogenic g roup .The integ rated optical density ratio value (IOD )of mRNA for APN gene was much higher in lithogenic group (1.08±0.35)than that of con -trol and UDCA preventive g roups (0.65±0.18and 0.72±0.23respectively )with the results of the enzy matic activity of APN as (6.10±2.53)U ·L -1,(8.01±2.89)U ·L -1and (23.64±10.36)U ·L -1in control ,UDCA preventive and lithogenic g roups respectively .Conclusion :UDCA prevents the formation of cholesterol gallsto nes most likely by inhibiting the lithogenic role of APN .
[J Peking Univ (Health Sci ),2001,33:469-471]
长丝巾的系法 基金项目：国家自然科学基金(39770719)资助Supported by the National Natural Sciences Foundation of C hina (39770719)
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JOURNAL OF PEKING UNIVERSIT Y (HEALTH SCIENCES ) Vol .33 No .3 Oct .2001
胆石形成的机制至今尚未完全明了，预防胆结石的研究报道也很少。80年代Schweisinger等发现适量摄入乙醇可能通过影响胆汁酸合成和降低胆汁饱和度抑制胆石形成;Lee则发现摄入阿司匹林能通过降低粘蛋白分泌而避免草原犬鼠结石的发生；最近,M oran[1]又证实食物纤维能降低肥胖人群胆石的发生率。我们近年来从人的胆汁中提取出一种来自毛细胆管上皮叫作氨肽酶N(aminopeptida N,APN)的物质，经过纯化后证实APN是一种相对分子质量为130×103的非黏蛋白性糖蛋白，具有较强的促成核活性[2]。还发现胆石病人胆汁中APN 活性较无结石者明显升高，给胆石病人服用熊脱氧胆酸(ursodeoxycholate,UDCA)后发现，胆汁饱和度下降的同时还伴随APN活性平行地降低[3]。为此，本文在实验性胆固醇结石模型中观察APN在胆固醇结石形成过程中的变化，并从分子水平上探讨UDCA对APN活性的影响及其预防结石的可能规律。
1 材料与方法
1.1 试剂
UDCA(江苏盐城生物化学制药厂)，胆固醇(北京化学试剂公司),L-亮氨酸-4-亚氨基-甲基香豆素(Sigma Co)。Trizol总RNA提取试剂盒(Gibco/ BRL公司产品)。
1.2 动物模型
新西兰兔(30只)，体重2.00～2.50kg，雌雄各半，由北京大学医学部实验动物中心提供。普通饲料饲养1周后，随机分为3组。对照组(10只)：每日喂普通颗粒饲料100g，结石组(10只)：每日喂饲含1.2g高胆固醇的成石饲料100g,UDCA组：每日喂含UDCA0.045g、胆固醇1.2g饲料100g。喂饲4周后，动物禁食12h，禁水6h，戊巴比妥(每千克30mg)耳缘静脉注射麻醉，开腹，迅速取肝组织置液氮保存；摘取胆囊，抽取胆汁，取5μl观察成石情况，余胆汁保存于-20℃备用。
1.3 APN表达
(1)RNA提取取100m g各组兔的肝组织，加入1ml Trizol，匀浆，加入0.2ml氯仿，震荡15s,4℃, 12000r·min-1，离心15min，取上清，加入等体积的异丙醇，弃上清，用1ml75%(体积分数)的乙醇洗涤沉淀，干燥沉淀，溶RNA于无RNA的水内, -20℃储存备用;(2)引物设计：根据兔APN基因的cDNA序列设计了一对引物，上游引物5′GC-CACCTCCACCATCAA3′，下游引物5′GAACA-GAGCCGCTGCCT3′，引物目的片段长度为403 bp；用GAPDH作内参，内参的片段长度为300bp;
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(3)RT-PCR反应：利用Super Script TM RT-PCR 第一链合成试剂盒。反应条件：先94℃变性2min，然后94℃,45s;54℃,30s;72℃,40s;28轮循环后，再72℃,5min。共进行28轮循环。PCR产物用10g·L-1琼脂糖凝胶电泳鉴定并照相，用LEICA 550IW图像系统测定每一条带与内参的积分光密度比值：积分光密度(IOD)代表相应条带mRNA的相对表达水平。
财政局局长1.4 胆脂测定
胆汁中的总胆固醇、磷脂、胆汁酸、总蛋白在7170A全自动生化分析仪上测定。CSI通过Carey 表计算[4]。
1.5 胆固醇结晶及结石的观测
(1)取新鲜胆汁滴在载玻片上偏振光显微镜下观察胆固醇结晶。(2)打开胆囊直接肉眼观察，若胆汁内存在成型、粗大颗粒者定为结石，其成分用红外光谱分光光度计定性。
1.6 氨肽酶N活性测定
参照Blackmon[5]的方法，在37℃、pH7.4、50 mmol·L-1Tris-Cl缓冲液中，以L-亮氨酸-4-亚氨基-甲基香豆素为底物，用荧光分光光度计在激发光为380nm，发射光为450nm条件下测定其活性。
1.7 统计分析
采用SAS统计软件，微机做One way anova检验和q检验。P<0.05为有统计学意义。
2 结果
2.1 成石情况
内表面结石组6只(6/10)出现胆囊结石,9只(9/10)出现胆固醇结晶，对照组和UDCA组未发现结石及结晶。结石粉末作成溴化钾压片红外光谱结果证实为胆固醇结石。
2.2 胆脂水平
面积换算公式>狼国
结石组胆汁中总胆固醇及CSI明显高于对照组和UDCA组(P值均<0.05)，为过饱和胆汁(表1)。代岳东
2.3 APN表达
结石组肝APN m RNA的IOD比值明显高于对照组和UDCA组(表2)。结石组胆汁的APN活性和总蛋白均比对照组和UDCA组明显升高(P值均小于0.05，表2)。
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表1 新西兰兔不同实验条件下胆脂测定结果(x±s,n=10)
T able1 The concentration of biliary lipids in different groups of rabbits(x±s,n=10)
Groups c(TC)/mmol·L-1c(PL)/mmol·L-1c(BS)/mmol·L-1ρ(TL)/g·L-1CSI Control2.33±0.195.95±1.5063.22±15.7336.5±8.90.80±0.09 Gall stone4.85±0.83＊＊■7.35±1.5557.90±12.1735.9±6.61.38±0.27＊＊■UDCA3.95±0.987.05±1.1965.09±14.9338.9±7.91.18±0.11
＊P<0.05,＊＊P<0.01,control vs gallstone group;UDCA vs gallstone.■P<0.05,UDCA vs gallstone group;TC,total cholesterol;PL, phosphol ipid;BS,bile acids;TL,total lipid.
表2 新西兰兔胆汁总蛋白浓度、
APN活性及肝APN mRNA水平(x±s,n=10)
Table2 T he concentration of total protein、APN activity in bil e and
the l evel of APN mRNA in liver tissue in different groups(x±s,n=10)
Groupsρ(T P)/g·L-1ρ(APN Activity)
/U·L-1孤山岛
APN m RNA
(IOD)
Control1.25±0.496.10±2.530.65±0.18 Gallstone4.58±0.93＊＊■23.64±10.36＊＊■■1.08±0.35＊＊■UDCA3.12±0.788.01±2.890.73±0.29
ρ,mass concentration;＊P<0.05,＊＊P<0.01,control vs gall stone group;■P<0.05,■■P<0.01,UDCA vs gallstone group;TP,total p rotein.
3 讨论
目前了解，在生理情况下，当摄入过多外源性胆固醇时，机体可能通过下调肝胆固醇合成限速酶(HMG-CoA还原酶)减少胆固醇的生成，同时上调胆汁酸合成的限速酶(胆固醇7α-羟化酶)刺激胆汁酸迅速合成，从而调节胆汁中酯类的相对比例，使胆汁胆固醇维持在正常的浓度。但当胆固醇的摄入量过多或高胆固醇食物摄入的时间过长，超过了肝的调节能力时，胆汁中由于胆固醇的绝对量过多或与胆
汁酸和磷脂的比例失常，导致胆固醇过饱和成为热力学上不稳定的“成石性胆汁”，同时在胆汁多种“促成核因子”的参与下，析出胆固醇结晶和形成胆固醇结石。这可能就是本实验研究中给新西兰兔喂高胆固醇饮食4周后,9只(9/10)出现胆固醇结晶和6只(6/10)形成胆固醇结石的机制。关于胆固醇过饱和与结石形成的关系，已通过无数实验研究和临床观察得到了证实，但是各种促成核因子的确定及其在胆固醇结石形成过程中所起的确切作用，报道不多；关于氨肽酶N作为一种新发现的促成核物质与结石形成的关系除本实验室的报道[2,3]外，介绍就更少。本研究结果显示：在高胆固醇饲料中加入0.045g·d-1UDCA后，胆囊胆汁中的胆固醇含量及其饱和指数虽然高于对照组但较结石组明显降低，变化尤其明显的是UDCA组胆汁中APN活性从喂高胆固醇饲料结石组的(23.64±10.36) U·L-1降至(8.01±2.89)U·L-1，几乎下降了两倍，接近对照组的结果[(6.10±2.53)U·L-1]；根据UDCA的药物学特征，它能通过抑制合成胆固醇的限速酶(HMG-CoA还原酶)的活性减少胆固醇的生成，自身又作为一种胆汁酸可扩大胆汁酸池，因而降低胆固醇的饱和度并可能促使胆固醇与磷脂形成囊泡(vesicle)，而扩大和增加胆固醇的溶解度[6]，本研究结果表明,UDCA对于促成核物质APN活性有显著的抑制作用，正由于它对APN成核作用的抑制，才使UDCA组的胆汁中既未见胆固醇结晶，也未发现胆石。这或许是APN在胆石形成中作用的反映和UDCA预防结石的理论基础。
参考文献
1M oran S,Uribe M,Prado M E,et al.Effects of fiber administra-tion in the prevention of gallstones in o
be patients on a reducing di-et.A clinical trial[J].Rev Gastroenterol M ex,1997,62(4):266-272
2陈祥柏，祝学光，张红军.胆汁中氨肽酶N的分离提纯及其成核作用的初步研究[J].中国普通外科杂志,2000,9(2):117-119
3陈祥柏，祝学光，张红军.UDCA对胆固醇结石患者胆汁中氨肽酶N的影响[J].中华肝胆外科杂志,2000,6(2):195-197
4Carey M C.Critical tables for cal cul ating the cholesterol saturation of native bile[J].J Lipid Rearch,1978,19:945-955
5Bl ackmon DL,W atson AJM,M ontro M H.Ass ay of Apical mem-brane enzymes bad on fluorogenic substrates[J].Analytic Biochem-istry,1992,200:352-358
6Park YH,Igimi H,Carey M C.Dissolution of human cholesterol gall-stones in stimulated chenodeoxycholate-rich and ursodeoxycholate-rich biles.An in vitro study of diss olution rates and mechanisms[J].
Gastroenterology,1984,87(1):150-158
(2001-01-08收稿)
(本文编辑：景 霞)
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李月廷，等 熊脱氧胆酸抑制兔胆结石形成的作用及机制
