Rearch paper 研究论文
22 January 2021, 40(1): 240-251 Mycosystema ISSN1672-6472 CN11-5180/Q DOI: 10.systema.200200黄孢原毛平革菌对R B B R脱色降解及其降解机制金令凯汪梦妮叶梓沫陈敏°
浙江工商大学食品与生物工程学院浙江杭州310018
摘要：为研究白腐真菌对蒽醌染料的生物降解机制，以白腐真菌黄孢原毛平革菌为脱色降解菌株，分 析了蒽醌染料活性艳蓝KN-R (R B B R)的浓度、金属离子及脱色参数对染料脱色的影响；采用紫外-可见光谱、红外光谱、气相色谱-质谱（G C-M S)分析和植物种子毒性实验进行降解产物分析，以揭示RBBR 可能的降解路径及其产物的毒性>结果表明：在pH 4.2、28°C、Sm m ol八的M n2+条件下，脱色降解200m g/L RBBR, 24h脱色率可达95%以上。推测RBBR的降解途径为：RBB R中连接苯环和蒽醌的氮键裂解，产生了1-氨基蒽醌和间-(P-羟乙基砜硫酸酯钠)苯胺。1-氨基蒽醌上的氨基被羟基取代，再经过氧化、脱环、重排产生了邻苯二甲酸，接着邻苯二甲酸氧化开环生成丁二酸；同时，间-(P-羟乙基砜硫酸酯钠)苯胺上的氨基被氧化，生成丁二酸及其他小分子酸、二氧化碳和水。植物种子毒性实验表明，黄孢原毛平革菌对RBBR有较好的脱毒作用。综上，黄孢原毛平革菌能高效降解高浓度的RBBR，同时可显著降低染料对植物的毒害作用。
关键词：黄孢原毛平革菌，活性艳蓝K N-R，脱色，降解路径，植物毒性
[引用本文】金令凯，汪梦妮，叶梓沫，陈敏，2021.黄孢原毛平革菌对R B B R脱色降解及其降解机制.菌物学报，40⑴:240-251 Jin LK; W a n g M N, Ye Z M, C h e n M, 2021. Decolorization a nd degradation m e c h a n i s m of reactive brilliant blue KN-R (RBBR) by Phanerochaete chrysosporium. Mycosystema, 40(1): 240-251
Decolorization and degradation mechanism of reactive brilliant blue KN-R (RBBR) by Phanerochaete chrysosporium
JIN Ling-Kai W A N G M e n g-N i Y E Z i-M o C H E N M i n°
School of Food and Biological Engineering, Zhejiang Gongshang University, Hangzhou, Zhejiang 310018, China
Abstract:Phanerochaete chrysosporium w a s ud to study the decolorization effects of
a n t h r a q u i n o n e dyes by white rot fungi u n d e r various p a r a m e t e r s of R B B R(initial concentration,
p H,t e m p e r a t u r e a n d metal ions).UV-Vis absorption s p e c t r u m analysis,FTIR analysis,G C-M S
基金项目：浙江省科技厅专项项目基金（2014C33027)：浙江省重中之重一级学科（2017S I A R201)
S u p p orted by the Special Project F u n d of Science a n d Technology D e p a r t m e n t of Zhejiang Province (2014C33027), a n d the M o s t Important Discipline in Zhejiang Province (2017SIAR201).
o Corresponding author. E-mail: chen m i n@z j g s u.e d u.c n
O R CiD: JIN Ling-Kai (0000-0002-6824-8905)
Received: 2020-06-15, accepted: 2020-08-03
240菌物学报Copyright ©2021 Institute of Microbiology, CAS. All rights rerved. |********** Http://journals-myco. Tel: +86-10-64807521
研究论文22 January2021, 40(1): 240-251 Mycosystema ISSN1672-6472 CN11-5180/Q
analysis a n d phytotoxicity test w e r e ud to analyze the possible degradation p a t h w a y s of R B B R a n d the toxicity of the degradation products.T h e results s h o w e d that the decolorization rate can reach m o r e than 95% in 24h at p H 4.2, 28°C a n d 5m m o l/L M n2+w h e n R B B R concentration w a s 200m g/L.T h e biodegradation p a t h w a y of R B B R w a s initiated by the cleavage of the nitrogen b o n d connecting the b e n z e n e ring a n d the a n t h r a q u i n o n e of R B B R,the n g e n e rated 1-a m i n o a n t h r a q u i n o n e a n d M-((3-hydroxyethyl b a r i u m sulfate s o d i u m sulfate)aniline.T h e a m i n o g r o u p o n the 1-a m i n o a n t h r a q u i n o n e w a s substituted by a hydroxyl g r o u p,a n d the n oxidized, d e-ringed,a n d rearranged into phthalic acid.T h e phthalic acid w a s oxidized to f o r m a small molecule organic acid succinic acid,at the s a m e t i m e,the a m i n o g r o u p o n the M-((3-hydroxyethyl b arium sulfate s o d i u m sulfate)aniline w a s oxidized to f o r m succinic acid a n d other small molecular acids,c a r b o n dioxide a n d w a ter.Phytotoxicity e x p e r i m e n t s h o w e d that the toxicity of R B B R could b e r e d u c e d by P.c/i〇/sc^p o厂/i/m.In /y s o s p o厂/i/m could effectively decolorize high-concentration R B B R,a n d reduce the toxicity of dyes to plants.
K e y w o r d s:Phanerochaete chrysosporium,reactive brilliant blue K N-R,decolorization, degradation p a t h w a y,phytotoxicity
蒽醌类染料是用量仅次于偶氮染料的第二大类染料，因其耐晒牢度性能好，并且 颜色鲜艳被广泛应用于丝绸、棉花、皮革、木材和造纸等工业（L i u&S a n g2004)。由于 蒽醌类化合物结构稳定，易于在生物体内富 集，且某些化合物具有三致性（致畸性、致 癌性、致突变性），因此对含蒽醌类物质的 废水处理引起了人们的关注（吕俊和于存2019)。活性艳蓝 K N-R(reactive brilliant blue K N-R，R B B R)是具有乙烯砜活性基的典型蒽 醌类染料，常用于棉麻等织物染色（张建英2013)。有文献表明当水体中活性染料浓度高于5.2m g/L时，会对水体生物有毒害作用 (Nilratnisakorn efci/. 2007)；通过进入食物 链，对水生生物的生存造成威胁（T a u b e r ef a/. 2008)；同时污染严重的水体还可能会影 响到人类的健康（O z e r ef a/.2005; Khalaf 2008)。此外染料会吸收太阳光，降低水体 透明度，易造成视觉上的污染（Aks u et a/. 2007)。因此，建立有效的方法从废水中除去染料物质至关重要。
目前从废水中除去R B B R的方法有很多，如生物法、膜处理法、絮凝、吸附、电圣诞节电影
化学法、电芬顿法、高级氧化、V辐射、微
波催化、酶法等方法（Ali&E l-M o h a m e d y 2012；于存和池玉杰2017)。采用物理化学
法单独处理R B B R都存在各自的缺点，如二
次污染、处理时间过久、高成本等问题。而
生物法处理蒽醌染料废水，因其成本低、效
果好、二次污染少等优点而受到越来越多的
关注（王怡琴等2019)。自B u m p u s ef a/. (198S)报道白腐真菌是一类能高效分解有
机污染物的功能性微生物后，以黄孢原毛平 Phanerochaete chrososporium
白腐真菌逐渐成为国内外研宄的热点之一，广泛应用于纺织业、造纸业、食品工业
等染料废水的处理（D i r k e f a/,2003)。目前刑事申诉状
己报道的能够脱色R B B R的微生物主要有细 菌、真菌等（S a r a t a l e e f a/.2011)。朱显峰等 (2012)利用蜜环菌的漆酶对R B B R进行脱 色，在染料浓度为80m g/L条件下脱色6h,
脱色率为90.33%；江莹等（2015)从污泥中
菌物学报241
金令凯等/黄孢原毛平革菌对RBBR脱色降解及其降解机制
分离得到的一株希瓦氏菌主要依靠胞外酶对R B B R进行脱色，在染料初始浓度为50m g/L时，经过48h脱色，可以达到81.84% 的脱色率；赵杰等（2018)对血红密孔菌产 漆酶基因进行重组后产漆酶，对64.5m g/L 的R B B R进行脱色，5h脱色率达91%; Hidayat e t a/. (2019)利用从印尼古农林贾尼国家公 园分离得到的Cerrena s p.B M D.T A.1菌株对 R B B R脱色，在低浓度（100m g/L)和高浓度 (1 000m g/L)下经72h脱色，脱色率均能 达到80%以上；张永等（2019)研宄了杏鲍 菇菌渣产漆酶对R B B R的脱色情况，结果显 示在染料初始浓度为300m g/L时脱色12h的 脱色率有71.2%。由上述文献可见，目前关 于R B B R的生物脱色仅在脱色菌株及脱色能 力考察，而对R B B R的生物降解机制鲜有报 道。因此，本文重点探究本实验室选育保藏 的白腐真菌 P.c/7ros〇5p o r/u m_g S〇75对 R B B R 的 脱色情况，并对其降解R B B R的降解机制进 行深入研究，从而为蒽醌类染料的生物降解 途径的研究奠定基础。
1材料与方法
1.1材料
1.1.1 菌种：P.c/7/-〇S05/3〇n't/m_g S〇75，本实验室选育保藏。
1.1.2种子培养基（g八)：葡萄糖20，麦芽 糖10，硫酸镁0.5，磷酸二氢钾4，胰蛋白 胨2，酵母粉2；发酵培养基（g/L)：葡萄 糖10，麦芽糖10，硫酸镁0.S，磷酸二氢钾4，胰蛋白胨2，酵母粉2。
1.1.3 染料：R B B R (C n H u l S b N a W u S s)，相对 分子量626.54。
1.2方法
1.2.1脱色实验：按本实验室前期建立的方法进行（吴茵等2016；赵振2018)。切取 lcm xlcm 左右的 P.c/)rosospor/tvnrgS〇75菌种
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块，接种至含有150m L种子培养基中的500m L锥形瓶中，在28°C、150r/m i n条件下 培养3-5d。其次按10%的接种量，移种至 300m L液体发酵培养基中，同条件培养6d。再次收集菌丝体，加入乙酸钠-乙酸缓冲液重 悬，添加比例为1:5 (菌丝湿重/乙酸钠-乙酸 缓冲液，W/V)。最后按实验设计加入R B B R，在150r/m i n条件下进行R B B R脱色实验。分 别研宄R B B R浓度、脱色参数（p H、温度、时间）和金属离子对脱色率的影响，设置 R B B R 浓度为 100、200、300、400m g/L，脱 色 p H 为 3、3.4、3.8、4_2、4_6、5，脱色温 度为23、28、33、38°C，脱色时间为0.5、3、6、9、12、24h，金属离子为5m m o l/L和 10m m o l/L 的 N a+、M g2+、C u2+、F e3+、M n2+。
1.2.2脱色率的测定：脱色率的测定参照张 桐等（2018)的方法：脱色率(％)=(脱色前染 料的初始吸光度-脱色后染料的吸光度)/脱 色前染料的初始吸光度x l O O%。
1.2.3紫外-可见吸收光谱分析：取200m g/L 的R B B R溶液、0.5h和24h的降解液上清，用上海美普达U V-3200型紫外可见分光光度 仪在200-800n m范围内进行全波长扫描(Kusvran et al. 2011)〇
1.2.4红夕卜光谱分析：采用0.45，膜过滤装 置分别过滤200m g/L R B B R溶液和24h降解液上清，滤液冷冻干燥成固体粉末后经溴化钾 压片（王喜全等2010)，用N I C O L E T-380傅 里叶红外光谱仪在4 000-400c m_1波段扫描。
1.2.5 G C-M S分析：取一定量的24h降解液上清经过冷冻干燥得到固体粉末。加入10m L 3m o l/L的盐酸，然后加入N a C I至饱和，将 饱和溶液转入分液漏斗，以等体积的乙醚为 萃取剂连续萃取3次。合并乙醚萃取液，经 旋转蒸发得到结晶固体后，加入适量的甲醇 溶解，然后进行G C-M S分析（吴茵等2016)。
G C-M S条件参照贺玲（2015)的实验参数，
242菌物学报
研究论文22 January 2021, 40(1): 240-251 Mycosystema ISSN 1672-6472 CN 11-5180/Q
图2 R BBR 浓度对脱色的影响
*代表与对照（脱
秀才造反色率最高组）的差异显著（P<〇.〇5); **代表与对照 (脱色率最高组）的差异极显著（P <0.01)Fig.
2
Effects
of
RBBR
concentration
c蛋白on
decolorization. * Denotes significant differences to control (P<0.05); ** Denotes extrem ely significant differences to control (P<0.01).
料浓度的提高而加深，说明实验室选育的菌 株有着极强的染料吸附能力。因为染料水溶 液和固相之间的质量传递阻力能被高浓度 染料提供的重要驱动力所克服（L i i et a /. 2013)，同时染料浓度越高，其毒性越强， 会对生物降解产生抑制作用；综合考虑脱色 效果、实际染料废水的复杂性及之后的降解
p H
图1不同p H 对R B B R 的脱色影响
*代表与对照
(脱色率最高组）的差异显著（P <0.05); **代表与
对照（脱色率最高组）的差异极显著（P <0.01)Fig. 1 Effects of different pH on decolorization of RBBR. * Denotes significant differences to control (P<0.05); ** Denotes extremely significant differences to control (P<0.01).
质量扫描范围50-500a m u 。
新闻作文200字1.2.6植物毒性实验：用乙醚对24h 降解液
上清萃取，萃取液经旋蒸至结晶，加蒸馏水 溶解，使其浓度达200m g /L 以进行植物毒 性实验（H a d i b a r a t a e f a /. 2013)。同时以蒸 馏水和200m g /L R B B R 溶液的处理作为对 照，按本实验室前期建立的方法进行小麦种 子毒性实验（吴茵等2016；赵振2018), 4d 后测定种子的萌发率（％)、胚根长度 (c m )、胚芽长度（c m )和种子鲜重（g ) 等特征参数。
2结果与分析
2.1 RBBR 脱色体系的建立
2.1.1 p H 对脱色的影响：由于p H 会影响黄孢 原毛平革菌菌丝体的生长以及其分泌的木 质素降解酶活性，同时木质素降解酶所带电 荷也会因p H 改变而改变，从而影响木质素 降解酶对染料所带电荷基团的吸附（谢清如 等2018)。因此在R B B R 浓度为100m g 八， 脱色温度为28°C 以及150r /m i n 的条件下， 考察不同 p H 卜 P . c /7rosos /3〇r /t 7m -gS 〇7s 对 R B B R 的脱色能力。脱色体系的p H 在
3.0-
4.2范围 内，R c /?rosospor /u m -g S 〇75 对 R B B R 具有较好的 脱色效果，24h 脱色率达90%以上（图1); 而再提高体系p H ，脱色率减小，差异极显著， 因此选择p H 4.2进行后续实验参数的优化。2.1.2 R B B R 浓度对脱色的影响：在p H 4.2、28°C 、 150r/min 条件下，考察 P . c /7rosos /3〇r /u m _g S 〇75 对不同浓度R B B R 的脱色率的影响。经过12h 脱色，各个浓度的脱色率都达到了 70%以上， 其中100m g /L R B B R 脱色率达到94.98%、 200m g /L R B B R 脱色率达到 90.36% (图 2)。 但是随着染料浓度的增加脱色率减小，其中 200m g A R B B R 脱色率变化差异显著（P <0.05 )， 300m g /L 和400m g /L R B B R 脱色率变化差异 极显著（P <0.01)，此外菌丝体的色泽随
着染
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菌物学报243
金令凯等/黄孢原毛平革菌对RBBR 脱色降解及其降解机制
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23 28 33 38
温度
Temperature (°C)
图3温度对RBBR 的脱色影响
*代表与对照（脱
色率最高组）的差异显著（P<0.05)
Fig. 3 Effects of tem peratu re on decolorization of RBBR. * Denotes significant differences to control (P<0.05).
2.1.4金属离子对脱色的影响：在p H 4.2、
28°C 、150r /m i n 条件下，展开金属离子对P .
chrasospon 'u /TTgscro 脱
色R B B R 的研宄。实验以
200m g /L 为R B B R 的初始浓度，分别添加 5m m o l /L 和10m m o l /L 的不同金属离子进行 脱色实验，脱色时间12h 。除了 Fe 3+和M n 2+
产物分析，选择200m g /L R B B R 进行后续脱色体系参数的优化。
2.1.3温度对脱色的影响：黄孢原毛平革菌 菌丝体活力的维持以及其分泌的木质素降 解酶活性受温度的影响很大，从而影响到最 终的染料脱色效果（谢清如等2018)。本 研宄在p H 4.2、R B B R 染料浓度为200m g /L 条件下，分别考察23、28、33、38°C 脱色体 系对脱色率的影响。12h 时在28、33、38°C 的体系下脱色率均达到85%以上，差异不显 著（图 3)。该结果表明 P . c /7r 〇50S p 〇/7'_-g S 〇75 对活性艳蓝的脱色温度范围较广，在废水处 理中具有较好的应用前景。李慧蓉（2005) 研究发现黄孢原毛平革菌在39°C 下进行降 解反应，且黄孢原毛平革菌在39°C 产生酶的 活性为23°C 的2-4倍，因此后续研究选取 38。。。
100 r
外，其余离子对R B B R 脱色影响不显著(表1)， 这是由于黄孢原毛平革菌脱色染料主要依 赖其独特的降解系统（主要是木质素过氧化 物酶U P 和锰过氧化物酶M n P )，而Fe 3+对 这两种酶的活力具有一定的抑制作用（陈英 等2015); M n 2+对黄孢原毛平革菌脱色R B B R 有显著促进作用，在本研宄条件下5m m o l /L
M n
2+的促进作用最强，这与徐梓一（2017) 的结果基本一致。因此后续研究选择5m m o l /L
M n
2+进行脱色。
表1金属离子对RBBR 脱色的影响
Table 1 The effects of m etal ion on decolorization of RBBR 金属离子
Metal ions
浓度
Concentration (mmol/L)
相对脱色率
Relative decolorization (%)N o n e -100
N a +
5100.75±1.05*10
99.35±2.15*C u 2+5101.20±1.13*10
98.85±1.35*Z n 2+5102.25±2.10*10
99.31±1.09*Fe3t 587.20±2.70*10
89.05±1.05*M n 2+5132.80±0.81*10
112.10±1.75*
注：*表示差异显著（P S 0.05)；未标注表示差异不显著
(P>0.05)
Note: * Indicates the significant difference (P<0.05);U n m a r k e d m e a n s the difference i s not significant (P>0.05).
2.1.5时间对脱色的影响：在己优化的脱色
参数（p H 4.2、38°C 、添加 5m m o l /L 的 M n S 04动漫背景壁纸
溶液）下，进行黄孢原毛平革菌脱色降解 200m g /L R B B R 实验，在 0.5、3、6、9、12、24h 取样测脱色率，在最优条件下，黄孢原 毛平革菌脱色R B B R 染料0.5h 脱色率达到 52.2%。经9h 后，脱色率可达91.2%。此后 脱色率效果逐渐减弱，脱色速度趋于平缓，
244
菌物学报
