第42卷第1期2021年1月
Vol42No1
Jan'2021
质谱学报
JournalofChine MassSpectrometrySociety
克拉霉素及其杂质KL和KO的
电喷雾串联质谱分析
蒋可志】，金勇2，王兆刚2，付君平2，秦欣荣2，侯仲轲2，潘远江1 !1.浙江大学化学系，浙江杭州310007#.浙江国邦药业有限公司，浙江绍兴312369)
摘要：作为微生物次级代谢产物衍生物，克拉霉素产品存在大量杂质，需要对部分微量杂质进行进一步的结构分析。本研究采用电喷雾串联质谱(ESI-MS/MS)技术与量化计算相结合，系统地研究了克拉霉素K及其杂质KL和KO的质谱碎裂规律。发现其质子化离子在串联质谱中主要发生一系列涉及侧链基团的碎
裂反应，在高质量区存在丢失CH4O.C8H12O3和(C8H12O3+CH4O)，在低质量区存在丢失大环内酯单元产生特征离子m/1581(5a-P)和m/z316.2(3a-1P)，或发生脱氧氨基糖苷的开环产生特征离子m/116.1(5c-P)本研究通过总结克拉霉素及其杂质的质谱碎裂规律，为克拉霉素其他杂质及其代谢产物的结构分析提供参考’
关键词：克拉霉素；电喷雾串联质谱(ESI-MS/MS)；质谱碎裂反应；量化计算
中图分类号:O657.63文献标志码:A文章编号：1004-2997(2021)01-0008-08
doi：10.7538/zpxb.2020.0006开放科学(资源服务)标识码(OSID):
Analys#sofClar#thromyc#nand
Its Impurities KL and KO Using ESI-MS/MS
JIANG Ke-zhi1,JIN Yong2,WANG Zhao-gang2,FU Jun-ping2,
QIN Xin-rong2"HOU Zhong-ke2"PAN Yuan-jiang1
(1.Chemistry Department,Zhejiang University,Hangzhou310007,China#
2.Zhejiang Guobang Pharmaceutical Co.LTD,Shaoxing312369,China)
Abstract:Clarithromycin has significant antibacterial effect against Gram positive bacte-ria"andhasbeenwidelyudasanimportantclinicalantibioticatprent'Asaderiva-tiveofmicrobialcondary metabolites"however"clarithromycinproductshavealarge numberofimpurities"andsometraceimpuritiesalsoneedfurtherstructuralanalysis'In thisstudy"the massspectrometricfragmentationreactionsofclarithromycin K and its impuritiesof KL and KO weresystematica l ystudiedbyelectrosprayionizationtandem mass spectrometry(ESI-MS/MS)and quantum calculation.Quantum calculation showedthattheamino N atom ofdeoxyaminoglycosides(the No5side chain unit)is
收稿日期：2020-01-17；修回日期：2020-04-05
作者简介：蒋可志(1980—)，男(汉族)，浙江永嘉人，副研究员，从事有机质谱研究。E-mail:jiangkezhi@
通信作者：侯仲轲(1967—)，男(汉族)，湖南长沙人，研究员，从事生物制药工程研究。E-mail：houzk2008@hotmal com 潘远江(1966—)，男(汉族)，湖南张家界人，教授，从事有机质谱研究。E-mail:panyuanjiang@
第1期蒋可志等：克拉霉素及其杂质KL和KO的电喷雾串联质谱分析9
themostpreferredprotonationsiteinthestructureofclarithromycin.Uponco l isional activation,the protonated molecules undergo a rie of proton migration and fragmentation reactions on side chain groups as the followings:1)The ionizing proton transfers to 9heO5aa9omin9heNo.5sidechaingroupand9riggers9helossofmacrolides9oforman oxonium ion of the dehydrided deoxyaminoglycoside(K5a-P%m/z158.1).2)The ionizing proton transfers t o the O5b atom in the No.5side chain group,which t r iggers the ring-opeaningreac ionof hedeoxyaminoglycosidesgroup ogiveacharac erisicfrag-ment ion of N-(3-hydroxybutylidene)-N-methylmethanaminium(K5c-P%m/z116.1).
3) Migra9ionof9heionizing pro9on9o9he O6a9om resul9sin9helossof me9hanol.
4) Migra9ionof9heionizingpro9on9o9he O3aa9om resul9s in9he forma ion of K3a%
whichundergoesmigra9ionof9hepyranouni9due9o9henucleophilica9ackof9heO5d atom of the No.5side chain unit,and the subquent loss of macrolides to form an oxo-niumiona9m/z316.2(K3a-1P).5)K3a canalsoundergonucleophilicreaciondue9o the nucleophilic attack of the O3c atom of the para hydroxyl,and subquent fragmen-9a9ion9oproduce9hecharac9eris9icion K3a-2P bylosingC8H12O3"andfur9hercleavage 9ogive9hecharac9erisicion K3a-2P-P via9helossofme9hanol.Theimpuri9iesof KL and KO have high similari9y9o clari9hromycin in s9ruc9ure"which only di f erin9he No.9sidechain uni9.Axpec9ed"9hey have very similar9andem massspec9ra"in which9hereareveralcharac9erisicneu9rallossofCH4O"C8H12O3and(C8H12O3+ CH4O)in9hehigh massregion"andabundan9charac9erisicfragmen9ionsa9m/z316"
m/z158and m/z116in9helow massregion.Thisworksummarizes9heMSfragmen9a-9ionlawofclari9hromycinandi9sanalogue"providesareferencefor9hes9ruc9urederiva-9ionof9heo9herimpuriiesofclari9hromycinandi9me9aboli9es.
Key words：clarithromycin；electrospray ionization tandem mass spectrometry(ESI-MS/MS)；MS fragmentation；quantum calculation
克拉霉素又称6-O-甲基红霉素A，学名为5--4-二甲胺四氢3-羟基-6-甲基2-毗喃氧基）-6-甲氧基-11,12,13-三羟基-2,4,6,8,10,12-六甲基-9-氧代3-（四氢-5-羟基-4-甲氧基-4,6-二甲基-2-毗喃氧基）十五烷酸-"-内酯，属于14元环大环内酯类抗生素+1切。克拉霉素适用于鼻咽感染、下呼吸道感染、皮肤软组织感染、急性中耳炎、肺炎、尿道炎及宫颈炎等感染症状的治疗，对链球菌属、肺炎球菌、葡萄球菌等革兰阳性菌的抗菌作用略优于红霉素，对诱导产生的红霉素耐药菌株也具有一定的抗菌活性。
克拉霉素属于微生物类次级代谢产物衍生物，其存在大量杂质，即使是全球最大的大环内酯类原料药生产商（浙江国邦药业有限公司）所生产的克拉霉素药品也存在需进一步分析个别微量杂质结构。电喷雾串联质谱技术具有快速、灵敏以及直接分析混合物等优点，在杂质结构分析中受到重视[68]°
本工作拟对克拉霉素及其杂质KL和KO 进行电喷雾串联质谱研究，总结质谱碎裂规律，以期为相关的杂质结构推导提供参考°
1实验部分
1.1仪器与装置
Agilent1260系列高效液相色谱仪：美国Agilent公司产品；micro TOF-Q H电喷雾四极杆-飞行时间质谱仪：德国Bruker公司产品。1.2样品和试剂
克拉霉素（K）及其杂质KL、KO：浙江国邦药业有限公司产品，化学结构示于图1。甲醇、甲酸：色谱纯，美国Sigma-Aldrich公司产品；水为去离子水，电阻率大于182M$•cm；用于准确质量校正的PEG1000溶液由本实验室制备。
10质谱学报 第42卷
图1克拉霉素(a)及其杂质KL(b )、KO(c)的结构式
Fig. 1 Structures of clarithromycin (a) and its impurities KL (b) , KO (c)
<3 实验条件
使用甲醇-水溶液！ f 1GG $将待测物溶
解并稀释至10 mg/L，通过注射泵以3 "L/min 注入电喷雾离子源，在正离子模式下离子化，以
PEG1000为外标溶液对仪器进行准确质量轴校
莫泊桑的代表作
正-仪器操作参数：雾化气为氮气，压力20 kPa ；
干燥气为氮气，流速2 L/min ；干燥气温度
250 °C ；毛细管电压一4・5kV ；在二级质谱实验
中，碰撞气体为氩气，目标离子的质量选择窗口
冬瓜炒肉4u 碰撞诱导解离（CID ）碰撞能量18 eV 0使用
Analysis version 4软件进行数据处理。
1.4量化计算
量化计算软件为Gaussian 03程序，采 用半经验理论MP3基组进行结构优化和频率 计算。完成结构优化后，进行反应物、中间物和 产物的结构频率计算时不存在虚频；而过渡态
结构存在唯一的振动虚频和合理的振动模式,
并且通过内禀反应坐标（IRC ）计算确认。本工 作研究对象的结构非常复杂，存在许多构象,
为获得相对最优结构，采用分子动力学软件对
某一优化结构进行动力学模拟，获得若干个初 始优化结构，并将能量最低的结构作为相对最
优结构。本文采用电子和热自由能的总和进行 能量讨论，所优化的结构由Gaussview 软件
（3. 09版本）显示。
2结果与讨论
2. 1克拉霉素的质谱碎裂研究
克拉霉素原样的液相色谱图示于图2,
K 及其杂质KL 和KO 的出峰时间分别为
12. 71、9・ 92、17・ 17 min 。经 ESI 电离，K 、KL
和KO 均容易产生［M+H ,+ ，即mF 748. 484 2、
763.494 1、777・510 0，确定其化学式分别为
C 38 H 70 NO13+、C 38 H 71 N 2 O13+ 和 C39 H 73 N 2 O13+。
采用高分辨Q-TOF 技术对［M+H ,+离子进
行二级质谱分析，结果示于图3，相关离子的质 荷比、丰度以及元素组成等信息列于表1-
以K 为例解析质谱碎裂规律。克拉霉素 质子化离子的质谱碎裂类似于多肽的流动质子
模式碎裂，带电质子可以在其柔性结构中各碱
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-
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4—
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—30—25—20
•
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图2克拉霉素原样的液相色谱图
Fig. 2 HPLC spectrum of the raw clarithromycin
sample
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第1期 蒋可志等：克拉霉素及其杂质KL 和KO 的电喷雾串联质谱分析11
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5io m/z
注：碰撞能量18 eV
图3克拉霉素(a)及其杂质KL(b )、
KO(c )的[M+H ]+离子高分辨串联质谱图
Fig. 3 Accurate MS/MS spectra of clarithromycin (a )
and its impurities KL (b ) and KO (c)
性位点间迁移，当带电质子迁移到解离质子化
位点时，会诱导相应的碎裂反应+10-12：-克拉霉 素结构中存在许多碱性位点，包括氨基N 、羰基
O 、醚键O 和羟基O 。其中，氨基N 和羰基O
的气相碱度明显大于醚键O 和羟基O，量化计
算结果示于图4。克拉霉素氨基N 质子化所形 成的离子K5c 的自由能比酮羰基O 质子化离 子K1和酯羰基O 质子化离子K9的自由能分
别低41. 8,51. 6 kJ/mol ，表明克拉霉素的最优 质子化位点在氨基N 上。因此，克拉霉素经
ESI 电离后，带电质子主要结合在氨基N 上,
形成质子化离子K5c o 经碰撞活化后，克拉霉 素质子化离子中带电质子开始从氨基N 向各
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解离质子化位点迁移，并引发相应碎裂。
开环碎裂至少涉及2个化学键的断裂，克
拉霉素的大环内脂骨架上只有1个解离质子化 位点(O 原子)，故其不容易发生骨架开环碎裂,
余秋雨作品质谱碎裂优先发生在侧链上，如大环骨架的6、
5、3号位上的醚键O 。
由于带电质子主要结合在大环骨架5号位 毗喃环的氨基N 上，故先从5号位侧链基团碎
裂入手研究克拉霉素质子化离子K5c 的碎裂 规律。克拉霉素骨架上5号位侧链脱氧氨基糖
苷基团的质谱断裂存在2种途径，示于图5。 在path-1中，K5c 克服93. 9 kJ/mol 的能垒使
其带电质子从氨基N 迁移到5a 位O 原子上，形
成异构离子K5a，同时自由能增加82. 2 kj/mol 。
K5a 只需跨越6 kJ/mol 的能垒就可以发生i -断 裂，并通过丢失大环内酯单元产生含毗喃环结
构的碎片离子 K5a-P(m/z 158. 1)。在 path-2
中，K5c 需克服106. 6 kJ/mol 的能垒使带电质
子迁移到5b 位O 原子上，形成异构离子K5b, 同时自由能增加94.6kJ/mol 。K5b 继续克服
17. 2 kJ/mol 的能垒发生电荷诱导的C —O 键
断裂，从而产生异构离子K5b2o K5b2继续克
服54.9 kJ/mol 的能垒发生i -断裂，引发脱氧
氨基糖苷单元开环反应，产生亚胺结构碎片离 子K5b-P(m/z 116. 1)，克拉霉素大环5号侧链
质谱碎裂的反应势能面示于图6- Path-1碎裂 途径的累积能垒为93. 9 kJ/mol ，远小于path-2 的159. 8 kJ/mol ，表明pth-1碎裂途径更易发
生，即碎片离子K5a-P 丰度为100%，而K5b-P 丰
度仅为9.6%，与表1的实验结果相符合。
克拉霉素及其杂质大环6号侧链发生的质
谱碎裂途径示于图7-当带电质子迁移到6a 位的O 原子上，形成异构离子KPa - KPa 发生 电荷诱导的丢失甲醇反应，产生碎片离子m/z
716.5，其途径为：1)直接丢失形成碎片离子
K6a-P1；2)邻基参与反应，即5号位上毗喃环 的邻位羟基亲核进攻6号位C 发生闭环反应 并丢失甲醇分子，产生碎片离子K6a-P2o 在 K6a-P1离子结构中，正电荷定域在6号C 上,
而在K6a-P2离子结构中，正电荷以带电质子
的形式迁移到碱性位点上，其自由能比K6a-P1
12
质谱学报 第42卷
注：$碎片离子相应的结构式列于图4〜8中平凡铸就伟大
表1
Table 1 Acc 克拉霉素及其杂质的高分辨串联质谱图中碎片离子信息
urate MS/MS data of clarithromycin and its impurities KL and KO
化合物
Compound
离子元素组成理论质荷比相对误差归属$
Assignment
相对丰度
Fragment ion
(m/z$
Elementary composition
Theoretical (m/z )Relative error/10 一6Relative intensity /%
K
748.4836C38 H 70 NO13748.4842—0. 7
[K+H ] +
22.9
716.4567C 37H 66NO12
716.4567
—1. 7K6a-P 0.8
590. 3916C30H 56NO10590.3899一2. 9K3a-2P 63.3558.3634C 29 H 52 NO9558.3637
0.5
K3a-2P-P 18.9540.3524
C 29H 50NO8
540.3531一1.2
K3a-2P-P2
1.2316.2106C16H 30NO5
福建咸饭316.2118一3.9K3a-1P 4.2
158.1184
C 8H16NO 2158.1176
一5.5K5a-P
100116.1067
C 6H 14NO 116.1070一2.9K5c-P
9.6
KL
763.4949
C 38H 71N 2O 13763.4951
一0.3
[KL + H ] +17.0
731.4688C 37H 67N 2O12731.46890.0KL6a-P
2.6605.4023C 30H 57N 2O 10605.4008
一2.6
KL3a-2P
46.8573.3756
C 29H 53N 2O 9573.3746 1.8KL3a-2P-P
22.5
555.3642C 29H 51N 2O 8555.3640 3.67.0
448.2904C 22H 42NO 8448.2905一0.312.5416.2644C 21H 38NO 7416.2643一0.39.8398.2535
C 21H 36NO 6398.2537
0.5
14.0
380.2441C 21H 34NO 5
380.2431一2.4 2.9
316.2113
C16H 30NO5316.2118 1.8KL3a-1P 4.4
158.1179C 8H 16NO2
158.1176
2.5
KL5a-P 100116.1069
C 6H 14NO 116.1070 1.2KL5c-P
10.8
KO
777.5103
C 39H 73N 2O 13777.5107
一0.6[KO+H ] +
26.8745.4828C 38H 69N 2O 12745.4845一2.2
KO6a-P
6.3
619.4155C 31H 59N 2O10619.4164
一1.5KO3a-2P 41.0587.3895
C 30H 55N 2O 9587.3902 1.3
KO3a-2P-P
25.5555.3628C 29H 51N 2O 8555.3640一2.1
3.6
462.3035C 23H 44NO 8462.3061一5.7 1.4412.2673C 22H 38NO 6412.2694
4.9
1.2398.2518C 21H 36NO 6
398.2537一4.8
5.3
316.2116
C16H 30NO5316.21180.7KO3a-1P 6.5
158.1178C 8H 16NO2
158.1176
一1.2KO5a-P
100116.1069
C 6H 14NO
116.1070
一0.5
KO5c-P
11.6
图4克拉霉素氨基N(a)和酮羰基O(b )、酯羰基O(c)质子化离子的优化结构
Fig. 4 Optimized structures of the N -protonated and the carbonyl O -protonated
clarithromycin
