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保护碱基

更新时间:2023-05-15 10:42:31 阅读： 评论：0

保护碱基
限制性内切酶识别特定的DNA序列，除此之外，酶蛋白还要占据识别位点两边的若干个碱基，这些碱基对内切酶稳定的结合到DNA双链并发挥切割DNA作用是有很大影响的，被称为保护碱基。
在分子克隆实验中，有时我们会在待扩增的目的基因片段两端加上特定的酶切位点，用于后续的酶切和连接反应。由于直接暴露在末端的酶切位点不容易直接被限制性核酸内切酶切开，因此在设计PCR引物时，人为的在酶切位点序列的5‘端外侧添加额外的碱基序列，即保护碱基，用来提高将来酶切时的活性。
  其次，在分子克隆实验中选择载体的酶切位点时，相临的两个酶切位点往往不能同时使用，因为一个位点切割后留下的碱基过少以至于影响旁边的酶切位点切割。
添加原则
1、添加保护碱基，需要考虑两个因素：一是碱基数目，一是碱基种类。
2、添加保护碱基时，最关心的应该是保护碱基的数目，而不是种类。什么样的酶切位点，添加几个保护碱基，是有数据可以参考的，见附表。
3、添加什么保护碱基，如果严格点，是根据两条引物的Tm值和各引物的碱基分布及GC含量。如果某条引物Tm值偏小，GC%较低，添加时多加G或C，反之亦反。
附表一、靠近PCR片段末端识别位点的酶切效率（Fermentas）
当识别位点靠近DNA分子末端时，有些限制酶的酶切效率非常低。表列出了Fermentas公司限制酶的识别位点靠近PCR片段末端不同碱基数的切割效率。（酶切时间为16小时）
Enzyme
Bp from the recognition site to fragment end
1
2
3
4
5
AanI (PsiI)
0
0-20
20-50
AarI
20-50
50-100
AasI (DrdI)
50-100
AatII
0
0-20
20-50
50-100
Acc65I (Asp718I)
0-20
50-100
AdeI (DraIII)
50-100
AjiI (BmgBI)
50-100
AluI
0-20
20-50
50-100
Alw21I (BsiHKAI)
50-100
Alw26I
50-100
Alw44I
0
20-50
50-100
ApaI
50-100
BamHI
50-100
BauI (BssSI)
0-20
20-50
50-100
BclI
0
50-100
BcnI (NciI)
20-50
50-100
BcuI (SpeI)
50-100
BfiI (BmrI)
50-100
BfmI (SfcI)
50-100
BfuI (BciVI)
50-100
BglI
20-50
50-100
BglII
0
50-100
Bme1390I (ScrFI)
20-50
50-100
分散的近义词BoxI (PshAI)
0
50-100
BpiI (BbsI)
50-100
Bpu10I
20-50
50-100
Bpu1102I (BlpI)
50-100
BDI (BsaJI)
0
50-100
BGI (BtsCI)
50-100
BJI (BsaBI)
0
50-100
BLI (BslI)
0
50-100
BMI (BsrDI)
0-20
50-100
BMII (BspCNI)
50-100
BNI (BsrI)
0
50-100
BSI (Bme1580I)
50-100
BXI (BbvI)
20-50
50-100
Bsh1236I (BstUI)
50-100
Bsh1285I (BsiEI)
0-20
50-100
BshNI (BanI)
50-100
BshTI (AgeI)
20-50
50-100
Bsp119I (BstBI)
50-100
Bsp120I (PspOMI)
20-50
50-100
Bsp1407I (BsrGI)
20-50
50-100
Bsp143I (Sau3AI)
50-100
Bsp68I (NruI)
0
50-100
BspLI (NlaIV)
50-100
BspOI (BmtI)
0
20-50
50-100
BspPI (AlwI)
0
50-100
BspTI (AflII)
0
0-20
50-100
Bst1107I (BstZ17I)
0-20
50-100
BstXI
示范社区0
50-100
Bsu15I (ClaI)
50-100
BsuRI (HaeIII)
0-20
20-50
50-100
BveI (BspMI)
0-20
50-100
CaiI (AlwNI)
0
0-20
50-100
Cfr10I (BsrFI)
20-50
50-100
Cfr13I (Sau96I)
50-100
Cfr42I (SacII)
50-100
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Cfr9I (XmaI)
20-50
50-100
CfrI (EaeI)
0
50-100
CpoI (RsrII)
50-100
CI (HgaI)
50-100
Csp6I (CviQI)
50-100
DpnI
50-100
DraI
0
0-20
50-100
Eam1104I (EarI)
0
50-100
Eam1105I (AhdI)
0
50-100
Ecl136II (EcoICRI)
50-100
Eco105I (SnaBI)
20-50
50-100
Eco130I (StyI)
0
50-100
Eco147I (StuI)
0
50-100
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Eco24I (BanII)
50-100
Eco31I (BsaI)
20-50
50-100
Eco32I (EcoRV)
20-50
50-100
Eco47I (AvaII)
50-100
Eco47III (AfeI)
0
0-20
50-100
Eco52I (EagI)
0-20
50-100
Eco57I (AcuI)
50-100
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50-100
Eco72I (PmlI)
0-20
50-100
Eco81I (Bsu36I)
50-100
Eco88I (AvaI)
50-100
Eco91I (BstEII)
20-50
50-100
EcoO109I (DraII)
50-100
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EcoRI
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EcoRII
0
0-20
20-50
50-100
EheI (SfoI)
20-50
50-100
Esp3I (BsmBI)
50-100
FaqI (BsmFI)
0-20
50-100
FspAI
0-20
20-50
50-100
FspBI (BfaI)
20-50
50-100
GsuI (BpmI)
50-100
HhaI
50-100
Hin1I (BsaHI)
50-100
Hin1II (NlaIII)
0
0-20
50-100
Hin6I (HinP1I)
0
0-20
50-100
HincII (HindII)
50-100
HindIII
0
0-20
50-100

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