第３８卷 第５期２０１８年０９月
西安科技大学学报
ＪＯＵＲＮＡＬＯＦＸＩ’ＡＮＵＮＩＶＥＲＳＩＴＹＯＦＳＣＩＥＮＣＥＡＮＤＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ
Ｖｏｌ．３８ Ｎｏ ５Ｓｅｐ ２０１８
ＤＯＩ：１０．１３８００／ｊ．ｃｎｋｉ．ｘａｋｊｄｘｘｂ．２０１８．０５１２文章编号：１６７２－９３１５（２０１８）０５－０７８３－０９
收稿日期：２０１８－０１－３０ 责任编辑：高 佳
基金项目：国家自然科学基金（５１３７５３７１，５１６０５３７９）；国家８６３计划项目（２０１５ＡＡ０２０３０３，２０１５ＡＡ０４２５０３－２）第一作者：董贵荣（１９８３－），女，甘肃兰州人，讲师，Ｅ ｍａｉｌ：８９６５９４６８＠ｑｑ．ｃｏｍ
通信作者：杨来侠（１９６１－），女，陕西耀县人，教授，博士生导师，Ｅ ｍａｉｌ：８６７３６８７６０＠ｑｑ．ｃｏｍ
组织工程肌细胞定向排列方法的研究进展
董贵荣１，杨来侠１，连 芩２，呼延一格２，高 扬１
（１．西安科技大学机械工程学院，陕西西安７１００５４；
２．西安交通大学机械制造系统工程国家重点实验室，陕西西安７１００４９）
摘 要：应用计算机检索ＰｕｂＭｅｄ数据库及ＷｅｂｏｆＳｃｉｅｎｃｅ数据库，检索关于细胞定向排列方法的文章，中文检索词为“肌细胞排列，组织工程，表面结构约束，表面化学修饰，力学刺激，电磁刺激”。总结近年来关于组织工程肌细胞定向排列方法，对其进行简要的综述，分析关键技术，探讨存在的问题并展望发展前景。肌细胞排列在细胞骨架重组、
膜蛋白迁移、核基因表达和ＥＣＭ重塑的过程中起到至关重要的作用。同时，对组织再生和调节组织的力学性能也有很大的影响。因此，细胞排列成为生物力学，细胞生物学，组织工程和再生医学应用中的关键技术。随着纳米和微制造等技术的发展，目前常用表面结构约束，表面化学修饰，外界刺激等方法，能有效诱导肌细胞定向排列，为进一步的细胞分化和形成肌小管提供条件。但是，目前的研究仍然存在一些不足，例如，马血清对细胞排列分化的促进机制仍不明确，仿生结构研究较少，极低频磁场对细胞排列的影响仍属空白等，是肌肉组织工程亟待解决的技术难点。最后，文章总结了在
未来技术发展中，通过细胞精准打印，开发智能材料等新工艺，新材料控制细胞定向排列，不仅
奠定了大尺寸三维支架制造和再生医学领域的理论基础，也是功能性肌肉组织的前瞻性研究方向，并将最终实现多层组织的集成，为临床应用提供研究基础。
关键词：肌细胞排列；组织工程；表面结构；表面化学修饰；力学加载；电磁刺激中图分类号：Ｑ８１９ 文献标志码：Ａ
Ｒｅｖｉｅｗｏｆｍｅｔｈｏｄｓｆｏｒｍｕｓｃｌｅｃｅｌｌａｌｉｇｎｍｅｎｔｉｎｔｉｓｓｕｅｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ
ＤＯＮＧＧｕｉ ｒｏｎｇ１，ＹＡＮＧＬａｉ ｘｉａ１，ＬＩＡＮＱｉｎ２，ＨＵＹＡＮＹｉ ｇｅ２，ＧＡＯＹａｎｇ
１
（１．ＣｏｌｌｅｇｅｏｆＭｅｃｈａｎｉｃａｌａｎｄＥｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｘｉ’ａｎＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙｏｆＳｃｉｅｎｃｅａｎｄＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｘｉ’ａｎ７１００５４，Ｃｈｉｎａ；２．ＳｔａｔｅＫｅｙＬａｂｏｒａｔｏｒｙｆｏｒＭａｎｕｆａｃｔｕｒｉｎｇＳｙｓｔｅｍｓＥｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｘｉ’ａｎＪｉａｏｔｏｎｇＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｘｉ’ａｎ７１０
０４９，Ｃｈｉｎａ）
Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｉｎｔｈｉｓｒｅｖｉｅｗｐａｐｅｒ，ｔｈｅｋｅｙｗｏｒｄｓｓｕｃｈａｓｍｕｓｃｌｅｃｅｌｌｓａｌｉｇｎｍｅｎｔ，ｔｉｓｓｕｅｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，ｔｏｐｏ ｇｒａｐｈｉｃａｌｐａｔｔｅｒｎｉｎｇ，ｓｕｒｆａｃｅｃｈｅｍｉｃａｌｔｒｅａｔｍｅｎｔａｎｄｍｅｃｈａｎｉｃａｌｌｏａｄｉｎｇ，ｈａｖｅｂｅｅｎｕｓｅｄｔｏｓｅａｒｃｈｆｏｒａｒｔｉｃｌｅｓｏｎｔｈｅｏｒｉｅｎｔａｔｉｏｎａｌａｌｉｇｎｍｅｎｔｏｆｍｕｓｃｌｅｃｅｌｌｓｉｎｔｉｓｓｕｅｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇｆｒｏｍｔｈｅＰｕｂｍｅｄａｎｄＷｅｂｏｆＳｃｉｅｎｃｅｄａｔａｂａｓｅｓ．Ｔｈｅｐｕｒｐｏｓｅｏｆｔｈｉｓｒｅｓｅａｒｃｈｉｓｔｏｏｖｅｒｖｉｅｗｔｈｅｃｕｔｔｉｎｇ ｅｄｇｅｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，ｐｏｉｎｔｏｕｔｔｈｅｅｘｉｓｔｉｎｇｐｒｏｂｌｅｍｓａｎｄｄｉｓｃｕｓｓｔｈｅｆｕｔｕｒｅｗｏｒｋｉｎｔｈｅａｒｅａｏｆｔｈｅｍｕｓｃｌｅｃｅｌｌａｌｉｇｎｍｅｎｔ．Ｐｌａｙｉｎｇａｃｒｉｔｉｃａｌｒｏｌｅｉｎｖａｒｉｏｕｓｃｅｌｌｂｅｈａｖｉｏｒｓｉｎｃｌｕｄｉｎｇｔｈｅｃｙｔｏｓｋｅｌｅｔｏｎｒｅｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ，ｍｅｍｂｒａｎｅｐｒｏｔｅｉｎｒｅｌｏ ｃａｔｉｏｎ，ｎｕｃｌｅｕｓｇｅｎｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎａｎｄＥＣＭ（ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｍａｔｒｉｘ）ｒｅｍｏｄｅｌｉｎｇ，ｃｅｌｌａｌｉｇｎｍｅｎｔｉｓｗｅｌｌｋｎｏｗｎｔｏｅｘｅｒｔｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｉｍｐａｃｔｓｏｎｔｈｅｔｉｓｓｕｅｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎａｎｄｉｍｐｒｏｖｅｄｍｅｃｈａｎｉｃａｌｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓｏｆ
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Ｋｅｙｗｏｒｄｓ：ｍｕｓｃｌｅｃｅｌｌｓａｌｉｇｎｍｅｎｔ；ｔｉｓｓｕｅｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ；ｔｏｐｏｇｒａｐｈｉｃａｌｐａｔｔｅｒｎｉｎｇ；ｓｕｒｆａｃｅｃｈｅｍｉｃａｌｔｒｅａｔｍｅｎｔ；ｍｅｃｈａｎｉｃａｌｌｏａｄｉｎｇ；ｅｌｅｃｔｒｏｍａｇｎｅｔｉｃｓｔｉｍｕｌａｔｉｏｎ
王自豪０ 引 言
先天性缺陷、损伤、肿瘤、原发性肌病、代谢性
疾病等各种原因造成的骨骼肌缺损和功能丧失临
床常见［１－６］。目前，针对体积肌肉缺损的治疗方法
主要是肌皮瓣移植、肌肉瓣移植，即取自身健康部
位的肌皮瓣来修复肩部，肘部，手臂等部位［７－１１］。
但由于可利用的肌肉来源有限，对供区损伤较大，
以及异体移植供体来源和免疫排斥等问题，使其
应用受到限制。随着组织工程的发展，尤其是骨
骼肌组织工程在肌肉组织再生和功能重建方面的进展，使人们看到了解决骨骼肌组织缺损和功能丧失等问题的希望。
肌肉组织工程的概念是指从病患或供体收集肌肉细胞，通过体外培养或组织工程支架培养构建能植入病患体内的功能性肌肉组织，修复和替代缺损或病变组织，促进功能恢复的一项技术，如图１所示［１２］。此外，肌肉组织工程还广泛应用于药物筛选［１３－１４］，构建肌肉驱动装置［１５－１７］，机器人装置［１８－２０］，和食品来源研究等领域［２１］。
支架是肌肉组织工程中的重要因素，常用的细胞定向排列方法有２种，一种是通过支架结构的约束，实现细胞在支架表面的定向排列，另外一种是支架本身可以有结构也可以无结构，种植或封装成肌细胞或卫星细胞，通过外界刺激实现细胞在支架上的定向排列，并向着肌组织方向分化，实现支架在组织内的修复［２２－２５］。现将肌肉组织工程的发展历史及目前广泛应用的几种肌细胞定向排
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列的方法介绍如下。
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图１ 肌肉组织工程
Ｆｉｇ．１ Ｍｕｓｃｌｅｔｉｓｓｕｅｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ
１ 肌肉体外组织工程
早在１００ａ前，Ｌｅｗｉｓ就首次进行了鸡胚胎腿部肌肉细胞的体外静态培养［２６］。２０世纪６０年代，Ｈｉｌｌ，ＤＫ等人解剖获得蟾蜍横纹肌，并对规则排列的纤维束进行了初步研究［２７］。７０年代末期开始，肌肉组织的研究方法和技术得到了重视。例如Ｖａｎｄｅｎｂｕｒｇｈ构建了一种力学刺激后形成的骨骼肌体外胶原模型［２８］。９０年代初期，Ｓｔｒｏｈｍａｎ等人将种植在薄膜上的的肌细胞分离后再次堆积，首次构建了三维体外可实现收缩功能的肌肉组织［２９］，被Ｄｅｎｎｉｓ团队称为“ｍｙｏｏｉｄｓ”［３０］。Ｌａｍ等人将在具有微结构的ＰＤＭＳ上定向排列和分化后的肌小管，转移到纤维蛋白凝胶中自组装形成
十五字４
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第５期董贵荣等：组织工程肌细胞定向排列方法的研究进展
三维组织工程支架［３１－３２］。研究证实，肌肉组织工
程的关键是肌细胞的定向排列，常用的细胞定向排列方法有２种，一种是通过支架结构的约束或表面化学修饰，实现细胞在支架表面的定向排列，目
权桂云
前常用的支架微制造方法有软刻蚀制造技术［３３］
，热模压制造技术［
３４］，电纺制造技术［３５］
，影印及溶剂浇注制造技术等［３６］
。另外一种是在支架中种植
成肌细胞或卫星细胞，通过外界给予一定的刺激
（如力学刺激［３７－３８］或电和磁的刺激［３９－４０］
），实现
细胞在支架上的定向性，并向着肌组织方向分化，最终完成支架在组织内的修复。
２ 支架结构促进细胞排列的方法
早在１９６４年，Ｃｕｒｔｉｓ就发现不同表面结构的
玻璃对细胞粘附生长机理有很大的影响［
４１］
，近年来，大量研究结果显示不同的结构特征，比如尺寸、形状等都能在很大程度上影响肌细胞的生长
和排列［
４２－４５］
，文中主要归纳了不同尺寸的支架结构对细胞生长的影响。２．１ 宏观尺寸的支架
悉尼大学ＸｉａｏＨｕａ等人将Ｃ２Ｃ１２和ｈＭＳＣｓ细胞种植在丝素基生物材料上，通过马血清的刺激观测到成肌细胞的定向排列和分化，证实该材料的表面粗糙度值越大硬度越高，对细胞的定向
排列，增值和分化越有利，如图２（ａ）所示［
４６］
。德国比勒菲尔德大学Ｖ．Ｋｒｏｅｈｎｅ等人使用具有２０～５０μｍ平行排列微孔的海绵，浸过高浓度Ｃ２Ｃ１２细胞悬液后，植入裸鼠的胫前肌，证明该支架能与
周围组织融合，在原位形成方向性肌纤维［
４７］
，阿肯色大学ＳｈｉｌｏｈＡ．Ｈｕｒｄ等人使用ＳｐｒａｇｕｅＤａｗｌｅｙ鼠的腓肠肌制备脱细胞支架，通过力学检测和体外培养证明，虽然与肌肉本身的力学强度有一定的差距，但是该多孔支架具有良好的生物相容性，能有效刺激细胞的延长和定向排列，如图２（ｂ）所
示［４８］
。
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图２ 宏观尺寸支架Ｆｉｇ．２ Ｍａｃｒｏｓｉｚｅｓｃａｆｆｏｌｄｓ
２．２ 中等尺寸的支架
Ｐｅｃｋｈａｍ，Ｐ．Ｈ等早在１９７６年就研究证实过支架上的槽能够有效诱导细胞的定向排列和分化，过去的几十年中，有很多组织致力于研究支架
表面上槽宽和形状对细胞排列和分化的影
响［４９－５０］
。
日本东北大学Ｖａｈｉｄ等人利用ＰＤＭＳ翻模制备了表面具有不同尺寸凹槽结构的ＧｅｌＭＡ水凝胶
５
８７ l Rights Rerved.
支架，并将２×１０６
ｃｅｌｌｓ／ｍＬ浓度的Ｃ２Ｃ１２细胞种
植到凹槽内，通过持续２ｍｓ的电脉冲（振幅２２ｍＡ，频率１Ｈｚ）刺激，使细胞定向排列，最终形成了肌小管，并证实脊宽的增加对细胞与定向排列程度成反比，其中槽宽为１００μｍ的支架能够更有
效的诱导细胞的定向排列和分化［
５１］
。ＳｈａｎｇｗｕＣｈｅｎ等人也做了类似的凹槽研究，使用胶原冻干
制备出凹槽支架，模拟肌纤维外的基底膜，证实基底膜能有效的促进肌肉生长和维持肌肉的完整
性，如图３（ａ）所示［４８，５２］
，通过检测证明，１２０～３８０
μ
ｍ范围内的槽宽对细胞的定向排列影响显著，但对细胞的分化影响不大。大量研究结果证实，对于微米级尺寸的凹槽结构而言，减小槽宽和增加槽深度都能有效促进细胞的定向排列。
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图３ 中等尺寸支架Ｆｉｇ．３ Ｍｅｄｉｕｍｓｉｚｅｓｃａｆｆｏｌｄｓ
除了表面凹槽结构以外，其他的表面形状也能有效引导肌细胞的定向排列和分化。９
０年代末期，日本Ｔｏｈｏｋｕ大学的ＶａｈｉｄＨｏｓｓｅｉｎｉ等人使用直径分别为１
８０，２５０，４００，和５００μｍ的尼龙线和镍６８７ 西安科技大学学报 ２０１８年
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第５期董贵荣等：组织工程肌细胞定向排列方法的研究进展
金属丝缠绕在玻璃片，细管和针头上，翻模制备出ＧＥＬＭＡ水凝胶，通过对支架上的细胞进行ＤＡＰＩ肌动蛋白染色证实，证实螺旋结构比平行排列的结构能更有效地提高肌小管的生成率，如图３（ｂ）所示［５３］。美国华盛顿大学ＨｅｅＳｅｏｋＹａｎｇ等人则制备了表面带有凹槽的ＰＬＧＡ支架，并种植于鼠四头肌，结果表明该结构的体内实验仍然能有效刺激细胞分化基因表达［５４］。美国伊利诺伊大学的Ｂａｊａｊ使用微刻蚀技术制备出直线，圆环及前２种混合形状的纤连蛋白支架，并以融合指数，细胞成熟度，定向排列情况和电刺激结果４个分化参数为标准，观察Ｃ２Ｃ１２细胞的分化情况，证实了直线并带有３０度弧度的形状对细胞的分化最为有利，如图３（ｃ）所示［５５］。在这之后，该团队还尝试用石墨
烯基质的支架促进Ｃ２Ｃ１２成肌细胞的定向排列和分化［５６］。此外，还有学者尝试使用在纳米薄膜上复合纤连蛋白线和纳米碳管促使细胞的定向排列，之后卷裹成圆管进行［５７］。
２．３ 微观尺寸的支架
支架上微米尺寸和纳米尺寸的槽都可以有效促进细胞的定向排列生［５８］。Ｋｉｍ等人使用光固化和纳米翻模技术制备带有纳米凹槽的ＰＥＧＤＡ水凝胶支架，模拟细胞外基质的环境，诱导心肌细胞定向排列。结果证明，槽宽从５０到８００ｎｍ的尺寸中，槽宽越大，越有利于新生鼠肌细胞的贴附生长，同时槽宽略大于或等于细胞尺寸时，对细胞的定向排列更为有利，如图４（ａ）所示［５９］。
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图４ 微观尺寸支架
Ｆｉｇ．４ Ｍｉｃｒｏｓｉｚｅｓｃａｆｆｏｌｄｓ
尽管中等尺寸和微米级别的槽宽都能刺激细胞的定向排列和生长，但２种方法还是有很大的区别，中等尺寸的槽宽通常大于或等于单个细胞的尺寸，利于细胞的粘附和迁移，并且通过自身结构约束细胞进行定向排列，而对于微型尺寸的微槽，尺寸往往比单个细胞尺寸还要小很多，因此这种结构主要通过模拟细胞外基质及体内环境，刺激细胞定向排列［６０］。
自从Ｆｏｒｍｈａｌｓ等在１９３４年利用电纺技术实现纳米纤维无纺布的构建之后，静电纺丝技术
就为大家所熟知。由于电纺丝可以模拟天然骨骼肌组织的各向异性，同时诱导细胞沿纺丝方向定向排列，因此，电纺技术也广泛应用于骨骼肌组织工程［３５，６１－６２］。曼彻斯特大学的ＪａｍｅｓＭ．Ｄｕｇａｎ等人通过旋涂工艺，将５～６ｎｍ的纳米纤维须定向排列制备成支架，观察到Ｃ２Ｃ１２细胞的定向排列和融合，如果在支架表面涂覆纤连蛋白，４ｄ后能够观察到肌小管的生成［６３］。由于纳米结构尺寸有限，多数支架限于二维结构，西安交通大学ＬｉｎｇＷａｎｇ等人将通过利用光固化技术，用光固化水凝胶包裹电纺丝制备出封装Ｃ２Ｃ１２细胞的三维结构支架，实现了细胞在三维支架上的伸长，定向排列和分化，如图４（ｂ）所示［６４］。
除了微米级别的表面结构和电纺技术外，表面化学处理也是诱导细胞的增值，粘附和分化的常用技术［６５］。Ｗｈｉｔｅｓｉｄｅｓ等人使用微接触印刷技术（Ｍｉｃｒｏｃｏｎｔａｃｔｐｒｉｎｔｉｎｇ，μＣＰ）技术，通过对硫醇和胶体自组装形成表面微结构［６６］。μＣＰ技术可使用多种生物分子材料，包括ｐｏｌｙ Ｌ ｌｙｓｉｎｅ（锁相环）、肽、纤连蛋白、层粘连蛋白和牛血清白蛋白，通过该表面改性技术形成具有微结构的基底层，用于诱导细胞排列。美国波士顿大学Ｗｉｌｌｉａｍｓ等人通过μＣＰ技术用纤连蛋白修饰热敏聚合材料ＰＩＰＡＡｍ，实现了人类血管平滑肌细胞的定向排
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