博苏多重MethyLight在结直肠癌相关基因ALX4和SEPT9甲基化检测中的应用
何琼;王冕;周建文;刘妮;赖英荣
【摘 要】[目的]探讨多重MethyLight方法在检测结直肠癌(CRC)外周血ALX4、SEPT9基因甲基化状态中的价值,为CRC无创检测提供新方法.[方法]采用不同的荧光报告基团标记ALX4、SEPT9基因甲基化探针,利用高敏感性、高特异性的多重实时定量甲基化特异性PCR方法(MSP,MethyLight),同时检测ALX4、SEP四基因在CRC外周血中的甲基化情况.[结果]ALX4、 SEPT9基因可分别在48％ (24/50),75％ (38/50)的CRC患者外周血及6％ (3/50),4％ (2/50)的健康人群外周血中检测到甲基化;与健康人群相比,CRC患者外周血中ALX4、SEPT9基因的甲基化水平均明显升高(P＜ 0.001).[结论]利用多重MethyLight多基因联合检测技术,可高效特异地检测到CRC外周血中ALX4、SEPT9基因甲基化水平明显升高.
【期刊名称】海棠意思《中山大学学报（医学科学版）》
常用文件扩展名【年(卷),期】2015(036)005
【总页数】6页(P657-662)
【关键词】荧光定量甲基化特异性PCR;结直肠癌;甲基化
【作 者】何琼;王冕;周建文;刘妮;赖英荣
【作者单位】中山大学附属第一医院病理科,广东广州510080;中山大学附属第一医院血管外科,广东广州510080;中山大学附属第一医院病理科,广东广州510080;中山大学附属第一医院病理科,广东广州510080;中山大学附属第一医院病理科,广东广州510080
【正文语种】中 文
【中图分类】R73
就结直肠癌 （colorectal cancer，CRC） 的自然病程发展来看，早期发现肿瘤是影响CRC 总体预后最重要的因素。早期CRC 的5年生存率可达90%以上，因此CRC 高危个体的识别和早期诊断显得尤其重要［1］。大量 研究结果表明，DNA 甲基化与肿瘤的发生关系密切［2］。在散发性CRC中，甲基化是肿瘤发生的早期分子事件［3-4］。近年不少研究选用相关基因DNA 甲基化作为检测CRC 的分子标记物［5］，尤其是外周血DNA 的检测［6-7］，既可以拥有比大便潜血试验（FOBT）高的敏感度，又可以避免电子肠镜检查的不适，
提高人群依从性，不但有重要的临床诊断意义，而且在大规模人群筛查有广阔的应用前景［8］。在生物医学研究中，甲基化特异性PCR （methylation specific PCR，MSP） 和实时定量甲基化特异性PCR （quantitative MSP，MethyLight） 应 用 最 广 ［9］。MethyLight 是 一 种 高 敏感、高特异的甲基化检测方法［10-11］。有研究报告，与MSP 相比，MethyLight 可检测到更低含量的DNA；且上下游引物扩增目的片段后，只有结合所需探针的目的片段，才能被识别，因此与单以引物为基础的PCR 传统方法相比，具有更高的特异性［12］。此外，由于肿瘤本身存在的异质性和个体之间的差异，单基因的检测方法受到敏感性或特异性的困扰。我们的前期研究亚硫酸盐测序（bisulfite quencing PCR，BSP）结果显示，与健康人群外周血相比，结肠癌细胞、结肠癌组织及结肠癌患者外周血标本中的ALX4（Aristaless-like homeobox-4）、SEPT9（Septin-9）基因甲基化水平增高。ALX4 被认为是可以直接调控LEF-1 的间质特异活性，而后者是与CRC 发病密切相关的Wnt／β-catenin 通路的重要组成部分，因而ALX4 可能在上皮间质转化作用中有重要作用，并参与CRC 的起病。SEPT9 是Septins 家族中的一个成员，研究认为，SEPT9 正常生理功能与维持细胞骨架、囊泡运输、细胞极性有关，SEPT9 的调节异常，如甲基化，可能引起细胞内外物质转运障碍、 细胞微管结构功能和细胞动力异常，并与癌症的发
生密切相关。据此，我们利用多重MethyLight 联合检测结直肠癌患者外周血中ALX4，SEPT9 基因甲基化情况，探讨该方法在外周血中检测CRC 的应用价值。茶经
掌纹怎么看
1 材料与方法
1．1 材 料
1．1．1 样本信息 实验所需标本50 例CRC 患者外周血来自中山大学附属第一医院，收集时间为2013年7 月1 日-2013年12 月20 日。50 例正常人外周血来自健康志愿者。采集外周血的50 例CRC 患者（男31 例；女19 例）手术时中位年龄为58 岁（28～85 岁）。肿瘤分期依据WHO 消化道肿瘤分期标准。采集外周血的研究对象相关临床数据见表1。所有CRC 病例均经病理确诊。外周血标本采集自空腹静脉血，抽取5 mL 至干燥试管。
表1 研究对象临床资料Table 1 Clinical characteristics of patients and healthy controls in this studyAge／years Group CRC Stage n ＜5050～5960-69≥70ⅠⅡⅢⅣ3610 Normal 17 20 11 2 50 10 53511 4 69401 9 32139 Median age 58 61 65 76 62
好唱又好听的歌1．1．2 仪 器 与 试 剂 ABI7500 扩 增 仪 （ABI，USA）；细胞和外周血基因组抽提均用
QIAamp DNA Blood Mini Kit （Qiagen，USA）。DNA 的甲基化亚硫酸盐修饰 （Sodium Bisulfite Modified） 利用的EZ DNA Methylation-Gold Kit 试剂盒 （ZYMO，USA）。具体抽提步骤按照试剂盒说明书所述。
1．2 方 法海底两万里的好词好句
1．2．1 样本DNA 提取及亚硫酸盐修饰 利用ZYMOEZ DNA Methylation-Gold Kit 试剂盒对DNA甲基化修饰，具体操作步骤依据试剂盒说明书。
我的旅行日记1．2．2 阳性、阴性对照DNA 结肠癌细胞株Lovo基因组DNA 提取后，紫外分光光度计测试OD值。用M．SssI Methyltransfera （新英格兰生物公司，美国） 处理。具体步骤参照试剂盒说明书。
处理后DNA 即已经过M．SssI 酶修饰过的DNA，再经亚硫酸盐修饰后，BSP 反应单克隆测序，获得100%甲基化后，作为阳性对照DNA。甲基化阴性对照DNA 购自Chemicon 公司 （加州，美国），获得商业DNA 后，参照上述步骤，经亚硫酸盐修饰、BSP 反应后测序，确证100%非甲基化后，作为阴性对照DNA。所有DNA 经亚硫酸盐修饰后，冻存于-80 ℃备用。
1．2．3 ALX4、SEPT9 甲基化处理产物纯化克隆测序 琼脂糖凝胶电泳进行割胶纯化，采用QIA Gel Extraction Kit 试剂盒 （Qiagen，USA），操作步骤依据试剂盒说明书。
1．2．4 多重MethyLight 联合检测ALX4、SEPT9 基因数据分析 内参基因ACTB，目标基因ALX4，SEPT9 三个基因分别探针标记不同荧光报告／淬灭 基 团 ：ALX4 基 因-Texas Red／ECLIPSE；SEPT9基因-FAM／ECLIPSE；ACTB 基因-CY5／BHQ2 （表2）。ABI7500，95 ℃预变性15 min；94 ℃变性15 s，60 ℃退火45 c，ABI 7500 读取FAM，Texas Red和CY5 荧光，共40 个循环。对于多重的荧光定量PCR 来说，PCR 反应添加剂可以有效地提高PCR反应效率，或者降低组分之间的互相干扰和抑制作用。在该多重体系中，添加甜菜碱作为PCR 反应添加剂。实验结果证明它对于GC 含量高的模板解链以及稳定单链DNA 分子具有明显的作用。数据分析：本研究MethyLight 检测各基因的甲基化含量（Percentage of Methylated Reference，PMR） 值计算方法如下：［（基因／ACTB） 样本：（基因／ACTB）阳性对照DNA］×100，该值≥4%，则判断该基因为甲基化，否则为非甲基化［10］。
1．3 统计方法
连续性计量资料，采用平均数与标准差或中位数与数值范围的描述。计数资料间比较采用卡方检验 （Pearson Chi-Square，χ2），所有统计描述及检验均用SPSS 13．0 软件进行。P ＜0．05 表示有统计学差异。
2 结 果
2．1 CRC 细胞株Lovo 中ALX4，SEPT9 基因甲基化测序鉴定（见图1）
2．2 ALX4 和SEPT9 基因启动反应CpG 位点甲基化情况
与健康志愿者外周血相比，CRC 患者外周血中ALX4，SEPT9 基因甲基化水平增高图2、3。
2．3 多重MethyLight 联合检测CRC 外周血中ALX4，SEPT9 基因甲基化
在CRC 外周血样本中，可检测到ACTB（内参基因），ALX4，SEPT9 基因的扩增信号（图4）。
ALX4，SEPT9 基因可分别在48% （24／50），75% （38／50）的CRC 患者外周血及6
% （3／50），4% （2／50）的健康人群外周血中检测到甲基化；与健康人群相比，CRC 患者外周血中ALX4，SEPT9基因的甲基化水平均明显升高 （all P ＜0．001，卡方检验，表3）。
表2 ACTB（内参基因），ALX4，SEPT9 基因MethyLight 引物及探针序列Table 2 MethyLight primer and probe of ACTB（control gene），ALX4，and SEPT9 genegene ACTB ALX4 SEPT9 primer （5′→3′）F：TGGTGATGGAGGAGGTTTAGTAAGT R：AACCAATAAAACCTACTCCT CCCTTAA F：TTAGGTATGAATGTTGAGATTTGCG R：CTACGACACCGAACTATAATAAACG F：GTCTTATAACCCAACACCTCGAC R：GCGTATTGAGTTGTTTATTGATATTTCG probe （5′→3′）CY5-ACCACCACCCAACAC ACAATAACAAACACA-BHQ2 TexasRed-TTATTGCGAGTCGT CGGTCGTTGTTATGG-Eclip FAM-ACCCGAACCGAAAC GAACCGATAACCC-TAMRA
图1 ALX4，SEPT9 基因甲基化修饰后序列鉴定Fig．1 The quence chromatogram fragments of ALX4 and SEPT9 gene
图2 ALX4 基因启动子区CpG 位点甲基化情况 （BiQ Analyzer 2．0）Fig．2 CpG Methyla
tion in promotor region of ALX4 gene （BiQ Analyzer 2．0）
图3 SEPT9 基因启动子区CpG 位点甲基化情况（BiQ Analyzer 2．0）Fig．3 CpG Methylation in promotor region of SEPT9 gene （BiQ Analyzer 2．0）
3 讨 论
全世界每年约有100 万的CRC 新发病例，并有接近50 万患者死于CRC。CRC 已成为危害人类健康的最常见恶性肿瘤之一［13］。CRC 的发病机制及治疗转归研究表明，早期发现CRC 的癌前病变——结直肠腺瘤、并切除腺瘤，可明显减低CRC发病和肿瘤死亡相关风险；另外，早期发现肿瘤，也是影响CRC 自然转归及预后最重要的因素。尽管人群筛查取得了一定成效，并使局部地区发病率有所下降，但因目前尚缺乏有效、敏感、简便的大规模筛查方法，全世界范围内，尤其是经济欠发达国家的CRC 发病率，正在逐年上升，其中，包括中国。
临床运用最广泛的FOBT 或肠镜为基础的检查手段，由于检查敏感度低或费用昂贵、检查有创并有潜在的严重并发症导致检查依从性低，难以用于大规模人群筛查。尤其是在现今
医疗体制下的中国，人群筛查若采用电子肠镜，还受到经济因素的制约。即便是在筛查体系相对完善的美国，愿意接受电子肠镜作为筛查手段的人群比例也比较低。为此，临床医生、预防医学专家和CRC 肿瘤基础研究专家都在共同努力着，试图寻找一种比传统FOBT 或电子结肠镜更为合适、准确、方便、依从性好的检查手段。近年来，有不少研究结果显示，采用外周血中相关基因DNA 甲基化检测CRC，就是一种有效的手段。
