第10卷 第7期中华男科学杂志V ol.10 N o.7 2004年7月National Journal of Andrology Jul.2004
・论著・
锌对硝普钠损害精子的保护性作用研究
杨麦贵1，杨 阳2，张竹映3，郝晓柯1，郑善銮1，钟立辉1，樊爱玲1，徐 葳1 (第四军医大学,1.西京医院检验科,2.学员旅，陕西西安710033;
3.中国铁道建筑总公司西安医院小儿科，陕西西安710016)
摘要: 目的：探讨锌对外源性一氧化氮(NO)供体硝普钠(S NP)损伤精子的保护性作用。 方法：利用相差显微镜及单细胞凝胶电泳分析锌对S NP影响精子运动能力、精子头尾连接及精子DNA链断裂的保护性。 结果:S NP 对精子运动能力有明显的抑制作用，精子彗星细胞百分率显著增加，精子头尾连接稳定百分率降低，而锌离子能提高精子的运动功能，防止精子DNA链的断裂和精子头尾连接的解离。 结论：锌对NO损伤精子有一定的保护作用，其机制可能与精子核染色质部位的巯基有关。
关键词：锌；精子；一氧化氮；硝普钠;DNA
中图分类号:R321.1 文献标识码:A 文章编号:100923591(2004)0720530204①
Study of Zinc in Protecting Sperm from Sodium Nitroprusside Damage
Y ang Maigui,Y ang Y ang,Zhang Zhuying,Hao X iaoke,Zheng Shanluan,Zhong Lihui,Fan Ailing,Xu Wei Department o f Clinical Laboratory,Xijing Hospital(Yang MG,Hao XK,Zheng SL,Zhong LH,Fan AL,Xu W); Cadet Brigade(Yang Y),Fourth Military Medical Univer sity,Xi’an,Shaanxi710033,China;Department o f Pedi2 atrics,Xi’an Hospital,China Railway Building Corp.,Xi’an,Shaanxi710016,China(Zhang ZY) Correspondence to:Hao Xiaoke,E2mail:Haoxkg@
Abstract: Objective:T o study the function of zinc in preventing human sperm from being damaged by s odium nitroprusside(S NP),an exter2 nal NO donor. Methods:Analys were made of the function of zinc in protecting sperm from being in fluenced by S NP in such aspects as sperm m otility,head2tail connection and the breakage of sperm DNA chain by using pha2contrast microscope and single cell gel electrophore2 sis(SCGE). Results:S perm m otility was obviously inhibited by S NP.The percentage of comet cells incread significantly but the stability of sperm head2tail connection decread.Z inc could prom ote sperm m otility,protect the DNA chain and prevent the sperm head2tail connection from breaking. Conclusion:Z inc can protect sperm from being damaged by NO.I ts mechanism may be related to the mercaptol group of sperm chromatin.
Natl J Androl,2004,10(7):5302532,537
K ey w ords:zinc;sperm;nitric oxide;s odium nitroprusside;DNA
锌对睾丸的发育十分重要。缺锌可影响睾丸的发育、精子的形成和睾酮的分泌[1]。精浆锌与精子密度、活力、活率和精子总数均有密切关系[2]，锌缺乏可导致机体抗氧化能力降低，影响精子运动，使精子DNA损伤。精子在进入雌性生殖道后，除具有足够的能量通过周围递质到达受精部位外，精子头尾连接的完整性和精子DNA的稳定更为重要。NO是一种不稳定的小分子有害气体，过量的NO可使精子运动功能降低[3,4]。锌在精子受精过程中起着重要作用，但对NO损害精子是否有保护作用目前少
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①收稿日期:2003208211；修回日期:2004204230
作者简介：杨麦贵(19542)，男，陕西澄城县人，副主任技师，本科，从事男性不育研究。
通讯作者：郝晓柯,E2mail:Haoxkg@
见报道，鉴于此，本文采用外源性NO作用精子观察锌的保护性。
1 材料和方法
1.1 材料 30例正常健康男性精液样品，取自本院有生育能力的青年自愿者，年龄23～30(26±2)岁。硝普钠(s odium nitroprusside,S NP)由北京双鹤现代医药技术有限责任公司提供。硫酸锌，溴化乙锭(ethidium bromide,E B)购自沈阳试剂二厂。低溶点和正常溶点琼脂为生命技术公司(G aitherburg,MD)产品。核糖核酸酶(Cat NO:R5000)、蛋白酶K(Cat N o:p2308)、二硫苏糖醇(Cat NO:D9779)均为Sigma 公司(St,Lou,MO)产品。Nikon AFX2ⅡA型荧光显微镜，由日本Nikon公司生产。精子、微生物动(静)态图像检测分析系统，由清华同方神火科技有限公司生产。相差显微镜，由日本Nikon公司生产。槐花
1.2 方法
1.2.1 锌对S NP影响精子运动能力的作用 30份精液标本，置37℃水浴箱待液化，用上游法获取优质精子[5],pH7.40.01m ol/L P BS调精子密度至2×109/L，每份1.5ml平均分为3组：对照组加pH7.4 0.01m ol/L P BS0.5ml;S NP组加300nm ol/L S NP0.5 ml;S NP2Zn2+组加入300nm ol/L S NP2214nm
ol/L Zn2+ 0.5ml。3组同时置37℃5%C O2孵箱中孵育4h后用精子、微生物动(静)态图像检测分析系统观察精子运动功能的变化[2,6,7]。
1.2.2 头尾连接稳定型精子百分率的观察 取6份上游法获得的优质精子标本，每份1.5ml平均分为3组，每组均按0.5ml分别加入300nm ol/L S NP、300nm ol/L S NP2214nm ol/L Zn2+及pH7.40.01m ol/ L P BS溶液。3组同时置37℃5%C O2孵箱60min，取50μl制成涂片，随机选取视野观察(×400)，计数100个精子，按以下公式计算出稳定型精子百分率:
稳定型精子百分率=
十二生肖故事稳定型精子
主梁与次梁的区别
稳定型精子+头尾断离精子
×
100%
1.2.3 精子DNA链断裂彗星细胞的观察 30份精液标本参照文献[8]用pH7.40.01m ol/L P BS液在4℃条件下连续洗涤两遍，再用pH7.40.01m ol/L P BS调节精子密度至2×109/L。每份受试精液1.5 ml平均
分为3组，按等体积分别加300nm ol/L S NP、300nm ol/L S NP2214nm ol/L Zn2+及pH7.40.01m ol/L P BS各0.5ml，均于37℃5%C O2孵育0、0.5、1、2、4 h。在冰冻玻片上铺上100μl7.5g/L的正常溶点琼脂，在室温下静置5min，为底层凝胶。6μl精子悬液(2×109/L)与54μl7.5g/L的低溶点琼脂在37℃条件下充分混匀，并立即铺在底层凝胶上,4℃静置8 min。120μl7.5g/L低溶点琼脂铺在第2层凝胶上, 4℃静置8min，为顶层凝胶。用弱碱性裂解液(含2.5m ol/L NaCl、100mm ol/L Na2E DT A、10mm ol/L T ris、10g/L硫氰酸肌氨酸钠、1%T riton X2100,pH10) 4℃作用1h，然后玻片依次在下列溶液中作用以解聚精子核DNA。首先在中性溶液(含2.5m ol/L Na2 Cl、5mm ol/L T ris、0.5g/L硫氰酸肌氨酸钠、10mm ol/ L二硫苏糖醇,pH7.4)中4℃作用1h，接着在中性溶液(含2.5m ol/L NaCl、5mm ol/L T ris、0.5g/L硫氰酸肌氨酸钠、10mg/L核糖核酸酶,pH7.4)中37℃作用4h，最后在中性溶液(含2.5m ol/L NaCl、5 mm ol/L T ris、0.5g/L硫氰酸肌氨酸钠、200mg/L蛋白酶K,pH7.4)中37℃条件下连续作用15h。玻片在文献[9]要求的条件下电泳60min，用15mg/L E B 染色、封片。选用蓝色激发光，在Nikon荧光显微油镜下选择无重叠、荧光信号强的精子核计数，分析精子核DNA损伤形成似扇形的彗星精子，每份样品每次计数100个精子[8,9]。
1.3 统计学分析 实验数值以x±s表示，组间比较进行t检验。
2 结果
2.1 锌对精子运动能力的保护作用 30例正常健康男性精液在S NP作用下精子运动能力显著下降，明显低于同时经S NP2Zn2+处理组和对照组，结果见表1。
表1 锌对S NP影响精子运动能力的保护作用(x±s,%)
T able1.The function of zinc in protecting sperm m otility from S NP (x±s,%)
G roup n S perm m otility S perm m otility(a+b)
C ontrol3079.86±7.3859.68±8.56
S NP3020.68±6.54312.76±6.583
S NP2Zn2+3081.79±6.9560.78±8.58开题报告意见
与对照组和S NP2Zn2+组比较,3:P<0.01
C om pared with the control and S NP2Zn2+groups,3:P<0.01
2.2 锌对精子头尾连接的保护作用 6例健康男性精液在S NP作用下稳定型精子百分率显著低于S NP2Zn2+组和对照组，表明Zn2+对精子头尾连接有着很好的保护作用，结果见表2。
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第7期 杨麦贵等 锌对硝普钠损害精子的保护性作用研究
表2 S NP和S NP2Zn2+对精子头尾连接的影响(x±s,%)
T able2.The in fluence of S NP and S NP2Zn2+on the head2tail con2 nection of sperm(x±s,%)
G roup n S perm stability
C ontrol6 98.36±6.45
S NP6 45.38±7.363学习辅导百问
S NP2Zn2+6 98.53±5.86
与对照组和S NP2Zn2+组比较,3:P<0.01
C om pared with the control and S NP2Zn2+groups,3:P<0.01
2.3 锌对精子DNA链断裂的保护作用 精子用S NP处理后可引起彗星精子。正常精子核在荧光显微镜下为圆形，而彗星精子是在精子核的一侧可见一些带有红色荧光的颗粒，即游离出细胞核的DNA 断片，形状似彗星，故称彗星细胞，见图1、2。精子用300nm ol/L S NP处理0.5h至4h彗星细胞百分率显著增加，有明显的时间2效应关系，而同时用300 nm ol/L S NP2214nm ol/L Zn2+处理的精子出现的彗星细胞极少，结果见表3
。
图1 完整精子核
Figure
1.Intact sperm nucleus
图2 彗星细胞
Figure2.C omet cell
表3 锌对S NP引起精子DNA损伤形成彗星细胞的保护作用(x±s,%)
T able3.The function of zinc in preventing S NP from damaging sperm DNA and causing comet cells(x±s,%)
G roup n
T ime(m in)
03060120240
C ontrol30 3.9±0.69.0±0.410.8±0.911.5±0.812.8±0.7 S NP30 5.0±0.651.0±1.0371.0±1.3379.0±1.4391.0±1.63 S NP2Zn2+30 4.0±0.39.1±0.511.0±0.811.8±0.912.6±1.0与对照组和S NP2Zn2+组比较,3:P<0.01
C om pared with the control and S NP2Zn2+groups,3:P<0.01
3 讨论
NO是一种简单的小分子有害气体，具有很强的亲脂性，难溶于水，极易通过细胞膜扩散。在细胞信息
传递、细胞防御和细胞损伤中起着重要作用。过量的NO对精子具有毒性，不仅降低精子的活力和活率，而且会使精子的直线运动速率下降[3,4]。锌是人体重要的必需微量元素，它作为体内百余种酶的辅助因子，与生殖系统代谢活动密切相关，尤其与生殖器官中的多种脱氢酶活性密切相关，锌参与精子的生成、成熟、激活、获能和凋亡过程，锌对精子的活动能力影响主要是延缓细胞膜的脂质氧化，以维持细胞结构稳定性和生理通透性，从而使精子有良好的活动力。精子在射出过程中吸收精浆内的锌与细胞核染色质的巯基结合，使染色质免于过早解聚，而有利于受精[2]。本文实验结果也表明S NP对精子的运动能力有明显的抑制作用，而Zn2+对精子起着保护作用，能提高精子的运动能力。
精子头尾连接处有二硫键和自由巯基的存在，锌对巯基有较高的亲和力，能起到抗生物氧化作用。当巯基与锌短暂结合时，巯基参与双硫键的断裂受到阻碍，稳定型精子百分率较高。在正常情况下，精子在锌的保护下，一直保持完整形态，直到它与卵子结合。进入卵子后，精子才发生头尾断裂，精子核染色质发生解聚，遗传物质释放进入卵细胞，锌就完成了它的使命[2]。锌对精子头尾连接起着非常重要的作用。我们的实验同样证明了这一点，高NO供体
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[18] G arry VF,T arone RE,K irsch IR,et al.Biomarker correlations of
urinary2,42D levels in foresters:genom ic instability and endocrine
disruption[J].Environ Health Perspect,2001,109(5):4952500. [19] M ahg oub AA,E l2M edany AH.Evaluation of chronic exposure of the
male rat reproductive system to the incticide methomyl[J].Pharma2
col Res,2001,44(2):73280.
[20] W yrobek A J,W atchmaker G,G ordon L,et al.S perm shape abnor2
malities in carbaryl2expod em ployees[J].Environ Health Perspect,
1981,40:2552265.
[21] Savitz DA,Arbuckle T,K acz or D,et al.M ale pesticide exposure
and pregnancy outcome[J].Am J E pidem iol,1997,146(12):10252 1036.
[22] E lbetieha A,Da’as SI,K hamas W,et al.Evaluation of the toxic
potentials of cypermethrin pesticide on s ome reproductive and fertility
parameters in the male rats[J].Arch Environ C ontam T oxicol,2001,
41(4):5222528.
[23] 胡静熠，王守林，赵人Μ，等.氰戊菊酯对雄性大鼠生殖内分
泌系统的影响[J].中华男科学,2002,8(1):18221.
[24] K ovacic P,Jacintho JD.Reproductive toxins:pervasive theme of ox2
idative stress and electron trans fer[J].Curr M ed Chem,2001,8
(7):8632892.
[25] Loeffler IK,Peters on RE.Interactive effects of TCDD and p,p’2DDE
on male reproductive tract development in in utero and lactationally
expod rats[J].T oxicol Appl Pharmacol,1999,154(1):28239. [26] Figa2T alamanca I,T raina ME,Urbani E.Occupational exposures to
metals,s olvents and pesticides:recent evidence on male reproductive
effects and biological markers[J].Occup M ed(Lond),2001,51
(3):1742188.
[27] Nellemann C,Vinggaard AM,Dalgaard M,et al.Quantification of
antiandrogen effect determ ined by Lightcycler technology[J].T oxicol2 ogy,2001,163(1):29238.
[28] M ones TK,Franz M,G ebhardt S,et al.Sertoli cells as a target for
reproductive hazards[J].Andrologia,2000,32(425):2392246.
(王书奎 编发)
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S NP可使精子完整性百分率降低，锌能保护精子免受损伤，所以精子完整率高。
NO在结构上具有活性很强的自由基结构特性，能加强精子膜的脂质过氧化反应程度，增加了对精子的毒害作用，可使精子细胞DNA氧化损伤，引起DNA链断裂[3,4]。NO还可降低肿瘤坏死因子α(T NF2α)水平，可通过抑制巨噬细胞核因子(NF2кB)活性，减少基因转录[10,11]。锌能够稳定精子DNA 的双螺旋结构，保护DNA免受过氧化的损害[1]。我们采用体外NO供体S NP对正常精子细胞进行处理，用单细胞凝胶电泳分析精子细胞DNA链断裂，结果显示,S NP处理的精子，彗星细胞发生率明显增加，经S NP2Zn2+处理后的精子彗星细胞发生率极低。这表明NO可引起人类精子细胞DNA链断裂，锌离子对精子的损伤有着保护性作用，其机制可能与精子核染色质部位的巯基有关。
参考文献
[1] 李积胜，徐鹏宵，贺 智.缺锌对大鼠睾丸精子细胞凋亡的影
响[J].中华医学杂志,1998,78(2):91293.
[2] 于素芳，白忠贞.精液微量元素锌铜及铅对精子质量的影响
[J].中国男科学杂志,2000,14(2):1372140.
[3] 杨麦贵，张竹映，郑善銮，等.一氧化氮与白细胞精子症不育
的关系探讨[J].细胞与分子免疫学杂志,2002,18(6):6342 636.
[4] 李 克，黄宇烽.一氧化氮对精子的调节作用及影响[J].中
华男科学,2001,7(3):1822184.
[5] 韦相才，田佩玲，陈平乐，等.精子分离两种方法的比较和评
价[J].中华男科学,2000,6(4):2342237.
[6] K vist U.Im portance of spermatoz oal zinc as tem porary inhibitor of
sperm nuclear chromatin decondensation ability in man[J].Acta
Physiol Scand,1980,79(6):1092201.
[7] 杨麦贵，张竹映，郑善銮，等.外源性一氧化氮对精子运动能
力的影响[J\〗.第四军医大学学报,2003,24(15):139721399.
[8] Fairbairn DW,Olive P L,O’Neill K L.The comet assay:a com pre2
hensive review[J].Mutat Res,1995,339(1):37259.
人间失格讲的是什么[9] 鲁海鸥，张 黎，张 宁，等.单细胞凝胶电泳检测人精子
DNA损伤[J].中华男科学,2002,8(6):4162418.
[10] K ang JL,Lee K,Castranova V.Nitric oxide up2regulates DNA2bind2
ing activity of nuclear factor2kappaB in macrophages stimulated with
silica and in flammatory stimulants[J].M ol Cell Biol,2000,215(12
2):129.
[11] 张 威，张 玮，倪 江.一氧化氮对精子功能的影响[J].中
普通话怎么说华男科学,2000,6(4):2552258.
(陆金春 编发)
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第7期 谈立峰等 农药杀虫剂的男(雄)性生殖毒性研究进展
