华法林抗凝治疗患者 CYP2C9 基因多态性的研究
霍梅1, 刘春1, 杨超2, 李体远3, 龚亮4
摘 要 : [ 目 的 ] 研 究 深 圳 地 区 口 服 华 法 林 抗 凝 治 疗 患 者 细 胞 色 素 P4502C9 ( CYP2C9) 基 因 CYP2C9*1、CYP2C9*2、CYP2C9*3 多态性的特点。 [ 方法 ] 应用聚合酶链反应- 限制性片段长度多态性分析方法 (PCR- RFLP) 检测 151 例口服华法林抗凝治疗患者 CYP2C9 基因 CYP2C9*1、CYP2C9*2、CYP2C9*3 的多态性。 [ 结果 ] 151 例口服华法林抗凝治疗患者中未检测出 CYP2C9*2 等位基因, CYP2C9*1、CYP2C9*3 等位基因的频率分别为 92.7%和 7.3%,CYP2C9*1*1、CYP2C9*1*3、CYP2C9*3*3基因型频率分别为 85.4% (129) 、14.6% (22) 、0 (0) 。 [ 结论 ] 深圳地区口服华法林抗凝治疗病人中存在 CYP2C9*3 突变基因, 使用华法林抗凝治疗时应检测患者 CYP2C9 的基因型。
关键词: 华法林; 抗凝; 基因; 多态性; 细胞色素 P4502C9
STUDY ON THE GENETIC POLYMORPHISM OF CYTOCHROME P450 ( CYP2C9) IN PA-
TIENTS WITH WARFARIN ANTICOAGULANT THERAPY HUO Mei, LIU Chun, YANG Cha
o,et al. (People’s Hospital of Shenzhen, The Second Affiliated Hospital of Medical College, Ji’nan Universi-ty, Shenzhen 518020, China)
Abstract: [ Objective] To study on the feature of CYP2C9*1, CYP2C9*2, CYP2C9*3 genetic polymorphisms of cy-tochrome P450 ( CYP2C9) in patients with warfarin anticoagulant therapy in Shenzhen area. [ Methods] The CYP2C9*1,CYP2C9*2, CYP2C9*3 genetic polymorphisms of cytochrome P450 (CYP2C9) were analyzed in 151 patients with warfarin an-ticoagulant therapy by polymera chain reaction and restriction fragment length polymorphism (PCR- RFLP). [Results] Therewere no CYP2C9*2 allele in 151 patients with warfarin anticoagulant therapy .The allele frequencies of CYP2C9*1, CYP2C9*3were 92.7% and 7.3% respectively. The genotype frequencies of CYP2C9*1*1, CYP2C9*1*3, CYP2C9*3*3 were 85.4%(129) , 14.6% (22) , 0 (0) respectively. [Conclusion] The CYP2C9*3 mutant is prent in patients with warfarin anticoag-ulant therapy in Shenzhen area. CYP2C9 genotype should be analyzed when using warfarin anticoagulant therapy.
Key words: Warfarin; Anticoagulation; Gene; Polymorphism; Cytochrome P4502C9
华法林 ( warfarin) 是香豆素的衍生物, 它通过抑制维生
素 K (Vit K) 环氧化还原酶活性, 阻止 Vit K 循环利用, 并使
Vit K依赖性凝血因子Ⅱ、Ⅶ、Ⅸ、Ⅹ无法激活, 从而发挥抗
凝作用
[1]
, 是广泛应用于临床的一种口服抗凝药, 存在 S- 华法
林 ( 左旋华法林) 和 R- 华法林 ( 右旋华法林) , S- 华法林是消
旋华法林片剂的主要成分, 人类对华法林的药物代谢也主要针
对 S- 华法林。华法林的代谢主要由一系列细胞色素 P450 酶催
化, CYP2C9 是细胞色素 P450 酶的一种亚型, 在人肝脏主要
由CYP2C9 介导华法林的羟化代谢, CYP2C9 基因具有遗传多
态 性
[2]
, 其 中 最 主 要 的 有 3 种 , 即 野 生 型 ( CYP2C9*1) 、
R144C突变体 ( CYP2C9*2) 和 I359L 突 变 体 ( CYP2C9*3) 。
R144C(CYP2C9*2) 突变体是多肽链第 144 位氨基酸由 Arg突
变为Cys, 导致该处的一个限制性内切酶 Ava II 位点丢失, 而
I359L突变体 (CYP2C9*3) 是多肽链第 359 位氨基酸由 Ile突变
为Leu, 导致该处的一个限制性内切酶 Nsi I 位点的丢失。国外
基金项目: 深圳市科技和信息局资助 (200602119)
作者简介: 霍梅 (1970- ) , 女, 硕士, 副主任技师, 研究方向: 血液
学检验
作者单位: 1.暨南大学医学院附属二院深圳市人民医院检验科; 2. 暨
南大学医学院附属二院深圳市人民医院心外科; 3 深圳市
人民医院临床医学研究中心; 4.广东医学院检验系实习生
研究表明携带 CYP2C9*2 和 *3 的个体, 影响华法林的代谢,
使个体间华法林的剂量相差较大, 国内关于口服华法林抗凝治
疗患者 CYP2C9 基因多态性的分布特点研究较少, 本文检测了
151 例 口 服 华 法 林 抗 凝 治 疗 患 者 CYP2C9 基 因 CYP2C9*1、
CYP2C9*2、CYP2C9*3 的多态性, 现报道如下。
1 材料与方法
1.1 研究对象
151 例受试者均为来我院就诊的患者, 因心脏机械瓣膜置
换术后、深静脉血栓、房颤、肺栓塞、冠心病等原因需口服华
法林抗凝治疗, 男 73 例, 女 78 例, 年龄 19~80 岁, 肝、肾功
能正常。
1.2 标本采集和制备
血液标本用含抗凝剂 3.2%枸橼酸钠硅化试管抗凝, 抗凝
剂与血液的比例为 1︰9, 采血后 30 min 内 3 000 r/ min 离心
15 min, 分别收集血浆和血细胞部分, 分装后- 80℃保存待检。
1.3 方法
1.3.1 基因组 DNA 提取 采用 EZ- 10 柱式血液基因组 DNA
抽提试剂盒抽提全血 DNA, 相关试剂盒购自上海生物工程公司。
1.3.2 目的片段的 PCR 扩增 分析 CYP2C9*2 的 PCR 上游引
物序列为 5'- TACAAATACAATGAAAATATCATG - 3'; 下游引
物序列为 5'- CTAACAACCAGACTCATAATG - 3', PCR 引物由
上海生物工程公司合成。PCR 反应体系为 25 μl, 含 DNA 模
板3 μl, 10 x PCR 缓冲液 2.5 μl, MgCl
2
3 μl ( 25 mmol/L) ,
dNTP 0.2 μl ( 10 mmol/L) , Taq DNA 聚合酶 2.5 U, 上游引物
0.5 μl ( 5 μmol/L) , 下游引物 0.5 μl ( 5 μmol/L) 。Gene Amp
PCR System 9700 型扩增仪 ( 美国基因公司生产) , 循环参数:
94℃预变性 5 min 进入循环, 94℃变性 20 s, 55℃复性 10 s,
72℃延伸 10 s, 共 35 个循环, 最后 72℃延伸 5 min。
分 析 CYP2C9*3 的 PCR 上 游 引 物 序 列 为 5' -
TGCACGAGGTCCAGAGATGC - 3'; 下 游 引 物 序 列 为 5' -
AAACATGGAGTTGCAGTGTAG - 3', PCR 引物由上海生物工程
公司合成。PCR 反应体系为 25 μl, 含 DNA 模板 3 μl, 10 x
PCR 缓 冲 液 2.5 μl, MgCl
2
2 μl ( 25 mmol/L) , dNTP 0.7 μl
( 10 mmol/L) , Taq DNA 聚 合 酶 1.0 U, 上 游 引 物 1.0 μl ( 5
umol/L) , 下游引物 1.0 μl (5 μmol/L) 。Gene Amp PCR System
9700 型扩增仪 ( 美国基因公司生产) , 循环参数: 95℃预变性
5 min 进入循环, 95℃变性 45 s, 59℃复性 30 s, 72℃延伸 2
min, 共 35 个循环, 最后 72℃延伸 5 min。
经 2.0%琼脂糖凝胶电泳, Gold View 核酸染料染色检测
PCR 产物, 得到预期大小的片断后, 再进行下一步的酶切反应。
1.3.3 限制性内切酶消化及电泳分型 酶切反应体系 30 μl,
含 PCR 产物 10 μl, 限制性内切酶 AvaⅡ ( CYP2C9*2 分析)
或 NsiⅠ (CYP2C9*3 分析) 1.5 μl (15 U) , 10 x 酶切缓冲液 3
μl, 混匀后置 37℃消化 4 h。用 4.0%琼脂糖凝胶电泳, Gold
View核酸染料染色分析结果。
1.4 统计学方法
应用基因计数法计算基因型频率和等位基因频率, 研究对
象与 Hardy- Weinberg 平衡 ( HWE) 的符合程度采用 χ
