Chine Journal of Tissue Engineering Rearch ｜Vol 25｜No.25｜September 2021｜4009
第2代测序技术鉴定人类白细胞抗原等位基因A*24:353及基因频率分析
何柳媚，陈 浩，钟艳平，全湛柔，邹红岩
文题释义：
人类白细胞抗原(human leukocyte antigen ，HLA)：是由人类白细胞基因复合体所编码的产物，位于第6号染色体短臂上。临床干细胞移植前配型需检测供受者HLA-A 、B 、C 、DRB1、DQB1五个基因位点相合的程度，供受者的HLA 配型达到一定相合要求才能进行造血干细胞移植。第2代测序技术(next generation quencing ，NGS)：又称“下一代测序技术”，是一种以“边合成边测序”为核心思想的高通量测序技术，能够在短时间内同时对上百亿碱基进行全长序列测定。
摘要
背景：人类白细胞抗原(human leukocyte antigen ，HLA)高分辨确认工作是造血干细胞移植前必不可少的步骤之一，随着工作的不断深入开展及被检测人群的持续增加，人类白细胞抗原新等位基因不断涌现。有些新基因由于发现较晚，相关报道较少，导致基因频率不能准确计算，在缺乏相应数据的情况下，容易造成分型结果的误判，导致配型不相合结果，影响移植配型成功率。目的：对HLA 一个等位基
因HLA-A*24:353进行检测确认，并对其出现频率进行分析。
方法：应用聚合酶链反应-直接测序分型方法对2019年9月至2020年5月间543例临床移植配型供受者进行HLA-A 、-B 、-C 、-DRB1、-DQB1五个位点检测，再用第2代测序技术对HLA-A*24:02/24:353模棱两可结果进行全长序列测定，得到HLA 高分辨分型结果，并计算HLA-A*24:353基因出现频率。
结果与结论：检出HLA-A*24:02/24:353模棱两可结果146例，采用第2代测序技术进一步鉴定后，检出HLA-A*24:353基因5例，占A*24组的比例为3.42%，在543例检测人群中出现比例为0.92%。结果提示HLA-A*24:353在中国可能并不罕见，进行临床移植配型供受者高分辨分型时，当出现HLA-A*24:02/24:353模棱两可结果时，需做进一步确认，以增加分型结果的准确性，提高移植配型的成功率。关键词：造血干细胞；移植；人类白细胞抗原；等位基因；频率；移植配型；血液
Next-generation quencing of identifying the human leukocyte antigen-A*24:353 and its gene frequency analysis
He Liumei, Chen Hao, Zhong Yanping, Quan Zhanrou, Zou Hongyan
Institute of Transfusion Medicine of Shenzhen Blood Center, Shenzhen 518020, Guangdong Province, China
He Liumei, Master, Associate chief technician, Institute of Transfusion Medicine of Shenzhen Blood Center, Shenzhen 518020, Guangdong Province, China Corresponding author: Zou Hongyan, Chief technician, Institute of Transfusion Medicine of Shenzhen Blood Center, Shenzhen 518020, Guangdong Province, China
Abstract
BACKGROUND: High resolution validation of human leukocyte antigen (HLA) is one of the esntial step before hematopoietic stem cell transplantation. With the continuous development of the work and the number of people tested continues to increa, human leukocyte antigen new alleles are constantly emerging. Due to the late discovery of some new genes and the lack of relevant reports, the gene frequency cannot be accurately calculated. In the abnce of relevant data, it is easy to misjudge the typing results. The result of mismatch affects the success rate of transplantation.
/10.12307.2021.012投稿日期：2020-06-05送审日期：2020-06-06采用日期：2020-07-14在线日期：2020-11-18中图分类号： R459.9；R318；S759.95文章编号：
2095-4344(2021)25-04009-04文献标识码：B
深圳市血液中心输血医学研究所，广东省深圳市 518020
第一作者：何柳媚，女，1980年生，广东省梅州市人，汉族，2005年暨南大学毕业，硕士，副主任技师，主要从事人白细胞抗原组织配型高分辨确认工作。
通讯作者：邹红岩，主任技师，深圳市血液中心输血医学研究所，广东省深圳市 518020/0000-0001-5840-011X(何柳媚)
引用本文：何柳媚，陈浩，钟艳平，全湛柔，邹红岩. 第2代测序技术鉴定人类白细胞抗原等位基因A*24:353及基因频率分析[J].中国组织工程研究，2021，25(25):4009-4012.
研究原著
应用聚合酶链反应-直接测序分型法(PCR-SBT)对543例临床移植配型供受者进行HLA-A 检测。
利用第2代测序技术(NGS)对HLA-A*24:02/24:353模棱两可结果进行鉴定，并计算HLA-A*24:353频率。
结果提示：
HLA-A*24:353在中国可能并不罕见，进行临床移植配型供受者高分辨分型时，需对HLA-A*24:02/24:353模棱两可结果做进一步确认，以增加分型结果的准确性，提高移植配型的相合率。
Rearch Article
0 引言 Introduction
异基因造血干细胞移植(allogeneichematopoietic stem cell transplantation，allo-HSCT)是治疗血液系统恶性肿瘤和先天性免疫缺陷的有效手段之一。供者和受者的人类白细胞抗原(human leukocyte antigen，HLA)相合程度越高，发生排斥反应和移植物抗宿主病的风险越低，移植成功机会越大。因此，移植前HLA高分辨分型检测结果的准确性是移植能否成功的关键。
HLA-A是经典的HLA-Ⅰ类分子，为移植相关的抗原，HLA-A*24:353等位基因于2016年由作者所在实验室首次发现，并由世界卫生组织HLA系统因子命名委员会正式命名，其与同源性最高的HLA-A*24:02等位基因的区别在于第6外显子1 018位碱基由A变为G，导致第316位氨基酸残基由赖氨酸(Lys)变成谷
氨酸(Glu)[1]。由于HLA-A*24:353发现时间较晚，相关报道较少，国际上一直将其判定为罕见型等位基因，中国的分型实验室也通常将HLA-A*24:02/24:353模棱两可结果直接判定为HLA-A*24:02，造成分型结果的误判。为了提高HLA基因分型准确率和供受者间的配型相合度，增加移植成功率，作者利用聚合酶链反应-直接测序分型法(polymera chain reaction-quence bad typing，PCR-SBT)对543例无血缘关系供/受者的HLA-A、-B、-C、-DRB1、-DQB1五个位点进行检测，再利用第2代测序技术(next gen-eration quencing，NGS)对其中的HLA-A*24:02/24:353模棱两可结果进行全长序列测定，以得到准确的分型结果，现将结果报告如下。
1 对象和方法 Subjects and methods
1.1 设计应用聚合酶链反应-直接测序分型法和第2代测序技术检测样本。
1.2 时间及地点 2019年9月至2020年5月在深圳市血液中心输血医学研究所完成。
1.3 对象 543例临床移植配型无血缘关系供受者。供受者血样均为EDTA抗凝，白细胞数要求大于3.0×109 L-1。
1.4 方法
1.4.1 实验试剂及仪器核酸提取试剂(台湾芮宝公司)；SeCore TM HLA基因分型测序试剂(美国One La
mbda公司)；TBG基因分型测序试剂(台湾芮宝公司)；NXType TM NGS试剂(美国One Lambda公司)；全自动核酸提取仪(MagCore HF16，台湾芮宝公司)；9700型PCR仪(美国ABI公司)；3730型测序仪(美国ABI公司)；ION Torrent S5测序仪(美国Thermo Fisher Scientific公司)。
1.4.2 基因组DNA制备使用全自动核酸提取仪和提取试剂提取外周血基因组DNA，DNA质量浓度为20-100 μg/L，纯度为1.6-
2.0。
1.4.3 聚合酶链反应-直接测序分型法分型采用商品化测序分型试剂盒，按试剂盒说明书对HLA- A、-B、-C、-DRB1、-DQB1位点的2，3，4外显子进行扩增，扩增产物纯化，再进行测序反应，测序反应产物纯化，最后用3730测序仪进行毛细管电泳。收集原始数据后，使用uTYPE7.2版(HLA SBT uTYPE 7.2 CMDP)软件分析，对HLA-A*24:02/24:353模棱两可结果的样本用TBG试剂增加检测第6外显子，再用uTYPE7.2版软件分析结果。
1.4.4 第2代测序技术分型对HLA-A*24:02/24:353模棱两可结果的样本用第2代测序技术进行全长序列测定，最终得到HLA-A准确的基因分型结果。
(1)DNA扩增和定量：按照商品化试剂盒说明书特异性扩增HLA-Ⅰ类(A、B、C位点)全长和Ⅱ类(DRB1和
DQB1位点)第2，3外显子。用磁珠法对扩增产物纯化，然后对产物进行定量，把Ⅰ类和Ⅱ类产物等摩尔混合。
(2)文库构建：应用ION Shear TM Plus试剂，把扩增产物随机片段化，片段两端接上小片段序列接头，筛选300-1 000 bp目标片段进行2次扩增，纯化后进行定量，制备文库。
(3)乳化PCR产物：经过乳化后在40 ℃等温扩增条件下，将小片段结合在磁珠上进行单克隆扩增，筛选出富集珠子作为测序模板终产物，加载至Ion 530TM Chip芯片上，在测序平台上分别加入4种脱氧核苷酸，开始测序。
(4)数据分析：用TypeStreamVisual TM NGS Analysis Software 软件进行数据处理和分析。
1.5 主要观察指标①HLA-A*24:353测序结果；
②HLA-A*24:353占A*24:02/24:353模棱两可结果的比例，以及占所有样本的比例。
2 结果 Results
2.1 HLA-A*24:02与HLA-A*24:353第6外显子差异碱基图见图1。
2.2 第6外显子测序分型结果对于A*24:02/24:353模棱两
OBJECTIVE: An allele of HLA-A*24:353 was detected and confirmed in HLA, and its occurrence frequency was analyzed.
METHODS: Polymera chain reaction-quencing-bad typing method was ud to detect five loci of HLA- A, B, C, DRB1, and DQB1 in 543 clinical transplantation matching recipients from September 2019 to May 2020. Next-generation quencing was ud to determine the full-length quence of
HLA-A*24:02/24:353 ambiguous results to obtain high resolution typing results of HLA and calculate the occurrence frequency of HLA-a *24:353 gene. RESULTS AND CONCLUSION: The ambiguous results of HLA-A*24:02/24:353 were detected in 146 cas. After further confirmatory tests using next-generation quencing, the results of HLA-A*24:353 gene were detected in 5 cas (3.42%) in A*24 group and 0.92% in 543 cas. The results suggest that HLA-A*24:353 may not be rare allele in China. When HLA-A*24:02/24:353 ambiguous results appear in clinical transplantation matching recipients for high resolution typing, further confirmation is needed to increa the accuracy of typing results and improve the success rate of transplantation matching.
Key words: hematopoietic stem cells; transplantation; human leukocyte antigen; allele; frequency; transplantation matching; blood
How to cite this article: he LM, CheN h, ZhoNg YP, QUAN ZR, ZoU hY. Next-generation quencing of identifying the human leukocyte antigen-A*24:353 and its gene frequency analysis. Zhongguo Zuzhi gongcheng Yanjiu. 2021;25(25):4009-4012.
4010｜中国组织工程研究｜第25卷｜第25期｜2021年9月
Chine Journal of Tissue Engineering Rearch ｜Vol 25｜No.25｜September 2021｜
4011
图1｜HLA-A*24:02:01:01与HLA-A*24:353等位基因第6外显子碱基差异
Figure 1｜Different basic groups of HLA-A*24:02:01:01 and HLA-A*24:353 at exon 6
可结果的样本，用TBG 试剂增加测定第6外显子，测序结果见图2，1 018位碱基为A ；HLA-A*24:353第6外显子测序结果见图3，1 018位碱基出现G 。
2.3 第2代测序技术分型结果 对 HLA-A*24:02/24:353模棱两可结果进行全长序列测定，HLA-A*24:353结果见图4，第1 018位碱基为G 。
图2｜HLA-A*24:02第6外显子测序分型结果
Figure 2｜Typing results of HLA-A*24:02 exon 6 quencing
图3｜HLA-A*24:353第6外显子测序分型结果
Figure 3｜Typing results of HLA-A*24:353 exon 6 quencing
图4｜HLA-A*24:353第2代测序技术分型结果
Figure 4｜HLA-A*24:353 detected by next-generation quencing
2.4 基因频率分析 在543例临床移植配型供受者中，检出HLA-A*24:02/24:353模棱两可结果146例，利用第2代测序技术进行全长序列测定后，检出HLA-A*24:353基因5例，比例为
3.42%，在543例检测人群中出现比例为0.92%。
3 讨论 Discussion
不同种族、不同个体的HLA 千差万别，为减少移植排异反应，提高移植成功率，移植前需检测供受者间相合的程度。供者与患者HLA 型不同的造血干细胞移植，将引起严重的移植排斥反应，危及患者的生命。MATTSSON 等
[2]
对异基
因造血干细胞移植植入失败病例进行回顾性分析，HLA 全相合造血干细胞移植的植入失败率仅为0.1%，而HLA 不相合的植入失败率高达5%(P < 0.01)。RUBINSTEIN 等
[3]
对脐血干
细胞移植植入失败相关因素进行研究，供者与受者之间 HLA 相合度较低是植入失败发生的独立危险因素，且可增加患者移植相关死亡率。关于HLA 哪个位点是影响造血干细胞移植预后的关键，2003 年美国 FHCRC 协作组和NMDP 均认为HLA-Ⅰ类和Ⅱ类的等位基因不相合都可以降低患者的长期生存率[4]
，而日本2002年JMDP 证据表明，HLA-Ⅰ类，特别是HLA-A 位点和B 位点的不相合可以降低患者的长期生存率，而HLA-C 和HLA-DR 没有明显影响[5]
。国际组织相容性工作组(International Histocompatibility Working Group ，IHWG)2009年统计东西方多个国家17 341例非血缘造血干细胞移植发现，HLA-Ⅰ类不相合的移植风险大于HLA-Ⅱ类不相合(P =0.002-0.007)。HLA-A 和HLA-B 是HLA-Ⅰ类分子中多态性表达程度最高的[6]
，在主要以恶性原发疾病患者为研究对象的大型回顾性研究中，与完全匹配患者相比，单个HLA-A 和HLA-B 不匹配的相对风险比分别为1.17-2.20和1.16-1.90[7]。因此，提高供患之间的HLA-Ⅰ类尤其是HLA-A
基因位点的相合很重要。
近些年，随着检测技术的提高和检测样本数量的增
研究原著
加，新等位基因不断被发现[8-13]，有些原本被认为是罕见的等位基因经大量样本验证后，已被确认为常见基因[14]。截止2020年4月，共发现HLA-A等位基因6 082个[15]。HLA-A*24:353等位基因于2016年由作者所在实验室首次发现，该等位基因与HLA-A*24:02:01:01等位基因序列最相近，其差异是在基因组DNA nt1018 A>G突变，编码序列中位于第6外显子的第316密码子由AAA变成GAA，导致第316位氨基酸残基由赖氨酸(Lys)变成谷氨酸(Glu)，该序列提交国际基因库(GenBank序列号：KX833882)和IMGT/HLA Databa (HWS10026837)，并被WHO HLA系统因子命名委员会正式命名。该基因在HLA分子上的分布有待进一步研究。
按照国际上对CWD等位基因的定义[16]，将HLA等位基因定义为3大类：常见等位基因(Common alleles)、确认等位基因(Well-documented alleles)、罕见等位基因(Rare alleles)。在参考群体中频率等于或大于0.001的等位基因，为常见等位基因。HLA-A*24:353因为发现时间较晚，相关数据报道较少，故暂被列为罕见等位基因。聚合酶链反应-直接测序分型检测方法是目前HLA高分辨分型的金标准[17]，也是国内分型实验室的常用方法，其局限在于模棱两可结果较多。第2代测序技术采用了大规模矩阵结构的微阵列分析技术，将所有短的单体型DNA片段序列与数据库参考序列比对，通过拟合计算，
拼接成完整的全长序列。该技术极大地降低了模棱两可的可能，在临床、骨髓库及科研样本HLA 分型的高通量测序中具有较好的应用前景和实用价值[18-19]。作者所在实验室先利用聚合酶链反应-直接测序分型方法对543例临床移植配型供受者进行HLA-A位点的2，3，4外显子进行扩增测序，再对HLA-A*24:02/24:353模棱两可结果的样本增加检测第6外显子，最后利用第2代测序技术对HLA-A*24:02/24:353模棱两可结果进行全长序列测定，以得到准确的分型结果。最终在146例模棱两可样本中检出HLA-A*24:353基因5例，比例为3.42%，在543例检测人群中出现比例为0.92%。这提示HLA-A*24:353在中国人群中并非罕见，按CWD的定义应将其归入常见等位基因。
国内外大量研究表明，异基因造血干细胞移植前人类白细胞抗原的高分辨组织配型有着非常重要的作用[20-24]，HLA 全相合造血干细胞移植对移植成功起着至关重要的作用。随着HLA新等位基因的不断发现，产生模棱两可的结果也在增加。常规的聚合酶链反应-直接测序分型方法因为只检测2，3，4外显子，不能对模棱两可结果进行准确判断，当测序分型出现HLA-A*24:02/24:353模棱两可结果时，HLA-A*24:353不能作为罕见等位基因被错误排除而直接判为HLA-A*24:02，需增加全长序列测定，或用其他的分型方法做进一步检测，以增加分型结果的准确性，提高移植配型的成功率。
作者贡献：通讯作者负责实验设计和审校，第一作者进行实验操作、资料收集、数据整理和成文，第二、三、四作者负责实验评估。
经费支持：该文章没有接受任何经费支持。
利益冲突：文章的全部作者声明，在课题研究和文章撰写过程中不存在利益冲突。
机构伦理问题：该研究的实施符合深圳市血液中心伦理委员会的相关伦理要求。
知情同意问题：参加实验的供者、患者均对实验过程完全知情同意。
写作指南：该研究遵守国际医学期刊编辑委员会《学术研究实验与报告和医学期刊编辑与发表的推荐规范》。
文章查重：文章出版前已经过专业反剽窃文献检测系统进行3次查重。
文章外审：文章经小同行外审专家双盲外审，同行评议认为文章符合期刊发稿宗旨。
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(责任编辑：MZH，ZN，JY)
4012｜中国组织工程研究｜第25卷｜第25期｜2021年9月
