收稿日期：2021-01-24；修回日期：2021-02-04
基金项目：河南省重点研发与推广专项（科技攻关）（212102110133）；河南省食用菌产业技术体系（S2013-09，S2013-09-G02）；河南省重大公益性行业专项（201300110700）
作者简介：刘
芹，女，助理研究员，主要从事食用菌生理活性物质研究。E-mail ：**********************
通信作者：孔维丽，女，副研究员，主要从事食用菌育种研究。E-mail ：*********************
平菇（Pleurotus ostreatu s ）是世界上栽培最广泛
的食用菌之一[1]，
由于其丰富的营养（如蛋白质、矿物质和维生素），显著的抗氧化、抗病毒、提高免疫
力等生物活性而受到消费者的青睐[2]。平菇易于栽培，可以在各种农业副产物（玉米芯、秸秆、麸皮等）上生长，其年产量在世界范围内持续快速增长[3]。目前平菇的栽培技术主要分为3种：生料栽培、熟
料栽培和发酵料栽培[4-5]。与生料栽培和熟料栽培
相比，发酵料栽培因其低污染、低成本、工艺简单、经济效益高等优点而在世界范围内广泛应用[4]。平菇栽培用发酵料是以秸秆、玉米芯等农业副产物为主要原料，加入少量的麸皮、石灰等，在微生物的参与下，经短期、好氧发酵而制备的[1]。玉米是我国三大粮食作物之一，玉米芯约占玉米产量的21%，是
粒径对平菇栽培用玉米芯发酵料代谢物的影响
刘
芹1，胡素娟1，孔维丽1，崔
筱1，袁瑞奇1，孔维威1，邱立友2
（1.河南省农业科学院植物营养与资源环境研究所
郑州
450002；2.河南农业大学生命科学学院
郑州
450002）
摘要：为了解玉米芯粒径对平菇栽培用发酵料中代谢物的影响，采用代谢组学技术分析添加不同粒径玉米芯的发
酵料中微生物代谢物及其代谢通路。结果表明，添加小粒径玉米芯（D 50=0.5cm ）和大粒径玉米芯（D 50=1.5cm ）的发酵料中微生物代谢物差异显著。在正离子（POS ）和负离子（NEG ）模式下分别筛选得到464种和201种差异代谢物，包括芳香族化合物、氨基酸、糖及醇类、脂质、生物碱等。差异代谢物分别富集到90条（POS 模式）和94条（NEG 模式）代谢通路，差异显著的有2条，分别为源自鸟氨酸、赖氨酸、烟酸生物合成生物碱和组氨酸代谢。说明不同粒径玉米芯发酵料中微生物代谢物具有显著差异，为发酵料栽培平菇原料选择提供了理论依据。关键词：平菇；发酵料；玉米芯；代谢组；差异代谢物中图分类号：S646.1+4
文献标志码：A
文章编号：1673-2871（2021）03-059-07
Analysis of metabolic differences in fermentation materials for Pleurotus ostreatus cultivation adding
corncobs with different particle sizes bad on the metabolomics
LIU Qin 1,HU Sujuan 1,KONG Weili 1,CUI Xiao 1,YUAN Ruiqi 1,KONG Weiwei 1,QIU Liyou 2
（1.Institute of Plant Nutrition,Agricultural Resources and Environmental Science,Henan Academy of Agricultural Sciences,Zhengzhou 450002,Henan,China;2.College of Life Sciences,Henan Agricultural University,Zhengzhou 450002,Henan,China ）
Abstract:Metabolomics technique was ud to analyze the differences of microbial metabolites in fermentation materials for Pleurotus ostreatus cultivation adding corncobs with different particle sizes.Results showed a significant difference between microbial metabolites in fermentation materials adding small particle （D 50=0.5cm ）and large particle （D 50=1.5cm ）of corncobs.464and 201differential metabolites were screened at POS and NEG modes,respectively,including aromatic compounds,amino acids,sugars and alcohols,lipids,alkaloids.The analysis of KEGG metabolic pathway showed that differential metabolites were enriched in 90（POS mode ）and 94（NEG mode ）metabolic pathways,respectively,and two of which were significantly different.They were Biosynthesis of alkaloids derived from ornithine,lysine and nicotinic acid and Histidine metabolism.The results indicat
ed that there were significant differences between the microbial metabolites in the fermentation materials adding corncobs with different particle sizes,which provided important information for the lection of cultivation materials and the improvement of cultivation techniques of P .ostreatus .Key words:Pleurotus ostreatus ;Fermentation material;Corncob;Metabolomics;Differential metabolite
中国瓜菜
2021，34（3）：
59-65
中国瓜菜第34
卷
一种产量巨大的农副产品，来源广泛、价廉易
得[6-7]。目前，
玉米芯除用于制备糠醛、木糖醇等外，很大一部分被作为农业废弃物直接燃烧，造成资源浪费和环境污染。玉米芯组织均匀、硬度适宜、吸
水性强，将其堆制发酵后用于平菇栽培，不仅有助于平菇产量和品质的提高，而且可以实现农业副产物的高效生物转化[7]。
微生物在发酵料制备过程中起着重要的作用，微生物群落动态变化影响有机物的降解，而有机物的降解决定了发酵的成熟度[8]。微生物能将培养料中复杂的有机质（纤维素、半纤维素、木质素等）进行降解，使其变成简单、易于利用的小分子物质，从而为平菇生长提供营养物质；有些特定微生物如Actinobacteria 、Thermus 和Bacillus 还可以产生抗菌、杀虫的物质，为平菇生长创造一个适宜的环境[9]。河南省农业科学院植物营养与资源环境研究所食用菌创新团队前期研究发现，不同粒径的玉米芯持水率、孔隙度等物理性质的不同导致发酵料升温开始时间、高料温保持时间、发酵周期及菌袋污染率等显著不同，这些指标影响了发酵料质量。发酵料质量与其中微生物的活动和代谢产物有关，目前还未有不同粒径玉米芯发酵料制备过程中微生物代谢差异的研究报道。
代谢组学（metabolomics ）是从整体角度出发，着重于分析全局来理解代谢网格、动态调节及控制代谢通路，运用现代检测技术对尽可能多的代谢产
物进行分析检测[10-11]。目前，
代谢组学在真菌领域的应用也日益广泛，为人们提供一个了解真菌代谢的独特途径[10-12]。笔者采用代谢组学方法解析大小粒径玉米芯发酵料中微生物代谢产物及其代谢通路的差异，解析粒径对发酵质量的影响机制，为提高发酵培养料质量、提高平菇产量提供理论依据。
1材料与方法
1.1
发酵料
发酵料组成（w ）：玉米芯84%，麸皮10%，石灰
5%，尿素1%，含水量68%。小粒径玉米芯（D 50=0.5cm ）、大粒径玉米芯（D 50=1.5cm ）、麸皮、石灰、尿素均购自本地农贸市场。1.2试剂与仪器
LC-MC 级甲醇、水、甲酸、醋酸铵（CNW Tech-nologies GmbH ，Germany ）。
BSA124S-CW 天平（Sartorius ）；1290UHPLC 色谱仪（Agilent Technologies Inc.，USA ）；Tripl
e TOF 6600质谱仪（AB Sciex Pte.Ltd.,USA ）；D3024R 高速冷冻离心机（Scilogex,USA ）；JXFST-PRP-24全自动样品快速研磨仪（上海净信实业发展有限公司）；普析GWB-1纯水仪（北京普析通用仪器有限责任公司）；KS-7200DV 超声仪（昆山洁力美超声仪器有限公司）。
1.3样品制备
试验于2020年3—4月在河南省农业科学院现代农业科技试验示范基地进行。根据文献[13-14]制备平菇发酵料。发酵料制备试验包含6个重复，每个重复包含250kg 原料（干质量）。玉米芯等原料拌匀后，按照1∶2.4~2.5（w /w ）的料水比加入自来水，机械搅拌30min ，堆置1d 后进行建堆，堆高60cm ，宽1.5m 左右，长度不限。此时培养料的含水量约为70%，pH 值9~10，颜色为金黄色。用直径5cm 的木棒在料堆上部、横竖间隔30~40cm 打通风孔，木棒要求插到料堆底部。发酵周期为10d ，料温升至45~55℃开始第1次翻堆，升至70℃以上每隔1d 翻堆1次，共4次，直至发酵完成。为了获得具有代表性的样本，发酵完成后，随机从发酵料堆的9个不同位置采集子样本，然后将子样本进行混合得到一个样本。设置组别：小粒径玉米芯发酵料为对照组（E 组），大粒径玉米芯发酵料为实验组（F 组）。1.4代谢组学分析1.4.1代谢物的提取
称取100mg 液氮研磨的发
酵料样本与500μL 的80%甲醇水溶液混合均匀后
置于冰浴，5min 后进行离心（15000r ·min -1，4℃，15min ）。收集上清液加入LC-MS 级水稀释至甲醇体积分数为53%；转速15000r ·min -1，
4℃离心15min ，收集上清液进行LC-MS 分析。
1.4.2色谱条件采用Hypesil Gold column 色谱柱（100mm×
2.1mm ，1.9μm ）；正模式：流动相为0.1%甲酸，流动相B 为甲醇；负模式：流动相A 为
5mmol·L -1醋酸铵，
pH 9.0，流动相B 为甲醇。色谱梯度洗脱程序：0~1.5min ，2%B ；1.5~12min ，2%~100%B ；12~14min ，100%B ；14~14.1min ，100%~2%B ；14.1%~17%，2%B 。柱温和流速分别为40℃和0.2mL·min -1。
1.4.3
质谱条件
扫描范围设置为m/z 为100~
1500；ESI 源：喷雾电压（spray voltage ）、鞘气（sheath gas ）流速、辅气（aux gas ）流速和毛细管温度（capil-lary temperature ）分别为3.2kV 、40arb 、10arb 和320℃；极性分为正离子（positive ）和负离子（nega-
第3期，
等：
粒径对平菇栽培用玉米芯发酵料代谢物的影响a
分组
a b
分组分组
[注] a.POS 模式，b.NEG 模式。
图1小粒径（E 组）和大粒径（F 组）玉米芯的发酵料样品的PCA 得分
a
b 分组
tive ）；MS/MS 二级扫描为data-dependent scans 。
1.4.4成分鉴定和分析采用ProteoWizard 和XCMS 软件对代谢组下机数据（.raw ）实施峰的识别、提取、积分及对齐等处理，利用mzCloud （/）、mzVault 和Masslist 数据库进行峰比对，同时采用blank 样本去除背景离子，进一步进行峰面积的批次归一化和自适换算标准化处理，从而得到代谢物的鉴定和定量结果。采用SIMCA 软件（version 14.1，sartorius stedim data analytics AB ，Umea ，Sweden ）对数据进行主成分（principal component analysis ，PCA ）和正交偏最小二乘判别分析（orthogonal partial least squares
discriminant analysis ，OPLS-DA ）
[15]
。1.5数据处理
试验数据均采用Excel 2016进行记录整理，采用SPSS 20.0进行Pearson 相关性分析以及单因素ANOV A 检验比较平均值，统计分析结果为0.05水平差异显著性，试验结果用平均值和SEM 表示。
2结果与分析
2.1
发酵料样品的主成分分析
分别在正离子（POS ）模式和负离子（NEG ）模式下筛选和鉴定得到了1208种和472种代谢物。为分析添加不同粒径玉米芯的发酵料中代谢产物的差异性，将数据进行PCA 分析。由图1可以看出，在POS 模式和NEG 模式下E 组和F 组数据点在空间分布上明显分离且各自具体成簇，表明不同粒径玉米芯发酵料中的代谢物存在显著差异。
[注] a.POS 模式，b.NEG 模式。
图2小粒径（E 组）和大粒径（F 组）玉米芯的发酵料样品的OPLS-DA 得分
为更充分地提取不同粒径玉米芯发酵料中代
谢物的差异信息，分析筛选两组之间的差异代谢物，进一步采用有监督的OPLS ‐DA 分析数据。由
图2可知，E 组和F 组数据点分别聚为一簇，且两组
数据点在空间上呈现明显分离现象，这表明不同粒径玉米芯发酵料代谢产物种类和（或）含量存在显
分组
a
b
刘芹
中国瓜菜第34
卷
著差异。OPLS ‐DA 模型质量参数，正离子模式下R2Y （cum ）=1.00，Q2（cum ）=0.97；负离子模式下R2Y （cum ）=1.00，Q2（cum ）=0.96。R2Y 和Q2均大于0.5，这表明在这两种采集模式下依据所得的数据建立的OPLS ‐DA 模型都具有较高的拟合性和较好的预测能力。
同时采用200次响应的置换检验来验证模型的过拟合现象，避免采用OPLS-DA 方法进行分析时出现过
拟合。图3为OPLS-DA 模型的置换检验结果。Q2的回归直线与y 轴的交点在负半轴；POS 模式R2Y （cum ）（0.0，0.84），Q2（cum ）（0.0，-0.84）；NEG 模式R2Y （cum ）（0.0，0.73），Q2（cum ）
a
b
R 2和Q 2值
R 2和Q 2值
相关系数值
相关系数值
F vs.E
（0.0，-1.02）。这表明建立的OPLS ‐DA 模型是稳健可靠的，不存在过拟合现象。因此，可以用于分析不同粒径玉米芯发酵料中代谢物的差异性。2.2差异化合物的筛选与分析
以p <0.05和VIP>1为条件筛选出具有差异性表达的化合物，在POS 模式下筛选鉴定得到464个差异代谢物，其中上调代谢物为214种，下调代谢物为250种（图4-a ）；在NEG 模式经过筛选鉴定得
a
b
-l o g 10（p 值）
-l o g 10（p 值）
log 2
（差异倍数）log 2
（差异倍数）[注]
a.POS 模式，
b.NEG 模式；R2Y 表示模型矩阵信息百分比，Q2表示原始模型的预测能力。
图3OPLS-DA 模型的200次循环置换检验结果
[注] a.POS 模式，b.NEG 模式。在火山图中，每个点代表一种代谢物，点大小代表PLS-DA 模型中代谢物的VIP （差异权重贡献）值；红色
圆点：显著上调的代谢物，绿色圆点：显著下调的代谢物，灰色圆点：无显著差异代谢物。
图4小粒径（E 组）和大粒径（F 组）玉米芯的发酵料样品中的差异代谢物火山图
F vs.E F vs.E
F vs.E
第3期，等：
粒径对平菇栽培用玉米芯发酵料代谢物的影响
入KEGG（Kyoto Encyclopedia of Genes and Ge-nomes）数据库进行代谢通路富集分析，共计富集到90（POS模式）和94条（NEG模式）代谢通路。其中，富集差异代谢物较多的为组氨酸代谢（Histidine metabolism）、源自鸟氨酸和赖氨酸及烟酸生物合成生物碱（Biosynthesis of alkaloids derived from orni-
、烟酸和烟酰胺代谢
）、苯丙素类
）、磷酸转移酶系统（Phosphotransfera system）、芳香族化合物的降解（Degradation of aromatic compounds）等（图6）。按p值从小到大的顺序进行了排序，共找到显著性富集的KEGG路径2条，分别为源自鸟氨酸、赖氨酸和烟酸生物合成生物碱（p=0.0059），主要包括哌啶酸（Pipecolic acid）、莨菪碱（Tropine）、
刘芹
到201个差异代谢物，其中上调代谢物为111种，下调代谢物为90种（图4-b）。
对筛选到的差异代谢物进行log2处理，变化最lo-5-phosphate）、炔诺醇（Nirvanol）、异戊烯基腺嘌呤（Isopentenyladenine）等物质的含量显著增加，而1-（2-呋喃基）戊烷-1，4-二酮（1-(2-Furyl)p
entane-1，
acid）、3-（4-羟
propionic acid）、
）、4-羟基-3-甲氧
acid）、
]-2,6-二甲氧基苯甲酰胺
苯基]丙烯腈
硫醇
-嘌呤-2,6-二酮
-2氢-氧杂环癸四烯-2-酮
}环己基）乙酸
-
2-硫酮
苯磺酰胺
乙酰胺
