河南农业科学,2021,50(1):142-151Journal of Henan Agricultural Sciences
doi :10.ki.1004-3268.2021.01.018
收稿日期:2020-06-28
基金项目：河南省农业科学院杰出青年科技基金项目(2020JQ06)；河南省生猪产业体系创新团队项目(S2012-06)；现代农业
(生猪)产业技术体系专项基金项目(CARS -35)
作者简介：周新宇(1996-)，女，河南信阳人，在读硕士研究生，研究方向：预防兽医学㊂E -mail:
陈鑫鑫为同等贡献作者
通信作者：张改平(1960-)，男，河南内黄人，中国工程院院士，研究员，博士，主要从事动物免疫学及动物病毒分子致病机制研
究㊂E -mail:
猪繁殖与呼吸综合征病毒类NADC30毒株与JXA1-R 疫苗株
荧光定量PCR 鉴别检测方法的建立及应用
周新宇1,2，陈鑫鑫2，乔松林2，郭振华2，李㊀睿2，邓瑞广2，张改平1,2
(1.河南农业大学动物医学院，河南郑州450002;2.河南省农业科学院动物免疫学重点实验室，河南郑州450002)
摘要：为鉴别检测猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV )类NADC30毒株HNhx 和JXA1-R 疫苗株，根据类NADC30毒株HNhx 和JXA1-R 疫苗株非结构蛋白2(Nsp2)基因序列差异，设计特异性引物和探针，建立TaqMan 荧光定量PCR 和SYBR Green Ⅰ荧光定量PCR 检测方法㊂结果显示,2种方
法中，标准品在103~108拷贝/L 均具有良好线性关系，标准曲线R 2值均在0.990以上；基于
TaqMan 探针法的荧光定量PCR 方法,JXA1-R 株㊁HNhx 株的最低检出量分别为104㊁103拷贝/L ,SYBR Green Ⅰ荧光定量PCR 方法的最低检出量均为100拷贝/L ；重复性分析结果显示，批内和
批间试验的变异系数均小于1.5%，呈现出良好重复性㊂综上，成功建立了鉴别检测类NADC30毒株HNhx 和JXA1-R 疫苗株的方法，且稳定性好㊁特异性强，可以为PRRSV 的鉴别检测提供技术支持㊂
关键词：猪繁殖与呼吸综合征病毒;JXA1-R 疫苗株;HNhx 毒株;TaqMan 荧光定量PCR ;SYBR
Green Ⅰ荧光定量PCR ；鉴别检测
中图分类号:S852.65㊀㊀文献标志码:A㊀㊀文章编号:1004-3268(2021)01-0142-10
Establishment and Application of Real-time PCR for Differentiation of Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome Virus Strains
NADC30-like and JXA1-R
ZHOU Xinyu 1,2,CHEN Xinxin 2,QIAO Songlin 2,GUO Zhenhua 2,LI Rui 2,
DENG Ruiguang 2,ZHANG Gaiping 1,2
(1.College of Veterinary Medicine,Henan Agricultural University,Zhengzhou 450002,China;
2.Key Laboratory of Animal Immunology,Henan Academy of Agricultural Sciences,Zhengzhou 450002,China)
Abstract :To distinguish JXA1-R vaccine strain and NADC30-like HNhx strain of por申请qq帐号
cine reproductive
and respiratory syndrome virus(PRRSV),TaqMan real-time quantitative PCR and SYBR Green Ⅰreal-time quantitative PCR were established by using specific primers bad on the difference of the regions of Nsp2genes between HNhx and JXA1-R.The results indicated that the standard products had a good linear relationship in the range of 103 108copiesdnf二级密码
/L,and the R 2of the standard curves were over 0.990in two
methods.The detection limit of the TaqMan-bad fluorescent quantitative PCR was 104copies /L (JXA1-R)and 103copies /L(HNhx),respectively.The detection limit of SYBR Green Ⅰfluorescent quantitative PCR was 100copies /L.The reproducibility of intra-and inter-assay displayed that the
㊀第1期㊀周新宇等：猪繁殖与呼吸综合征病毒类NADC30毒株与JXA1-R疫苗株荧光定量PCR鉴别检测方法的建立及应用coefficient of variations was less than1.5%,the repeatability was good.In conclusion,the method for differentiation of HNhx and JXA1-R was successfully established in this study,which exhibited good stability and high specificity,and provided a new technical support for the differential detection of PRRSV.
Key words:PRRSV;JXA1-R vaccine strain;HNhx strain;TaqMan real-time quantitative PCR;SYBR GreenⅠreal-time quantitative PCR;Differential detection
㊀㊀猪繁殖与呼吸综合征(Porcine reproductive and respiratory syndrome,PRRS)是由猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)引起的以妊娠母猪发生流产㊁木乃伊胎㊁死胎及弱胎等繁殖障碍以及仔猪与育肥猪呼吸道疾病为主要特征的病毒性传染病[1-2]，该病在全球范围内传播，给世界养猪业造成了巨大的经济损失㊂PRRSV是一种有囊膜的单股正链RNA病毒，基因组全长约15kb，含有10个开放阅读框[3-4]㊂ORF1a和ORF1b分别编码pp1a和pp1ab多聚蛋白,pp1a和pp1ab分别被关于花的四字成语
酶切裂解为至少16种非结构蛋白[5-6]㊂其中，非结构蛋白Nsp2是不同毒株基因组差异最大的区域[7]㊂2006年，我国暴发了由高致病性PRRSV(High pathogenic PRRSV,HP-PRRSV)引发的以高热㊁高发病率和高死亡率为特征的PRRS疫情,HP-PRRSV在Nsp2蛋白序列中存在30个氨基酸的不连续缺失[8-9];2012年，我国报道了与PRRSV经典毒株NADC30核苷酸相似性很高的毒株，命名为类NADC30毒株(NADC30-like strain)，其在Nsp2蛋白上存在131个氨基酸的不连续缺失[10-11]㊂自2013年以来，类NADC30毒株检测率急剧上升，并且类NADC30毒株与其他田间毒株重组频繁，迅速成为河南省乃至全国的优势流行毒株[12-14]㊂
PRRSV的检测方法有很多种，包括病毒分离和鉴定㊁ELISA㊁间接免疫荧光试验(IFA)㊁血清中和试验(SN)㊁实时荧光定量PCR(Real-time PCR)㊁逆转录环介导等温扩增(RT-LAMP)等方法[15-16]㊂但在实际的生产应用中，大部分方法只能检测而无法区分不同PRRSV毒株㊂运用荧光定量PCR技术和基因测序等分子生物学技术是目前鉴别检测PRRSV 最有效的方法[17]，根据Nsp2基因序列建立的荧光
定量PCR检测方法是目前用于区分PRRSV不同毒株的主要方法㊂鉴于此，基于不同毒株Nsp2基因序列缺失差异[18]，针对以HP-PRRSV毒株JXA1为亲本得到的疫苗株JXA1-R和河南省滑县采集样品中新分离鉴定的类NADC30毒株HNhx基因序列[19]，以期建立能够检测区分疫苗株JXA1-R和类NADC30毒株HNhx的TaqMan荧光定量PCR方法和SYBR GreenⅠ荧光定量PCR方法，旨在为PRRSV的快速鉴别检测提供技术支持㊂1㊀材料和方法
1.1㊀病毒及模板
PRRSV疫苗株JXA1-R购自普莱柯生物工程股份有限公司；类NADC30毒株HNhx(GenBank No.KX766379.1)由河南省农业科学院动物免疫学重点实验室分离保存㊂猪流行性腹泻病毒(PEDV) cDNA㊁塞尼卡病毒(SVA)cDNA㊁猪伪狂犬病毒(PRV)DNA㊁猪圆环病毒2型(PCV2)DNA和非洲猪瘟病毒(ASFV)的p72基因质粒均由河南省农业科学院动物免疫学重点实验室保存㊂
1.2㊀主要试剂
TRIzol LS试剂购自Invitrogen公司；反转录试剂盒PrimeScript RT Master Mix㊁Ex Taq DNA聚合酶㊁JM109感受态细胞㊁pMD20-T载体和Premix Ex Taq(Probe qPCR)试剂盒等均购自宝生物工程(大连)有限公司;SYBR Green Master购自Roche公司；质粒提取试剂盒购自康为世纪生物科技有限公司㊂1.3㊀引物和探针设计合成
应用MegAlign软件对PRRSV JXA1-R株和HNhx株的Nsp2基因序列进行分析，运用NCBI中在线软件Primer-BLAST分别设计引物，并根据探针设计原则设计探针，用Oligo7软件评估探针㊂通过对修饰基团分析，选择FAM和CY-5作为探针5ᶄ端标记的荧光报告基团，针对荧光报告基团选择BHQ-1和BHQ-2作为3ᶄ端标记的荧光淬灭基团㊂本研究使用的引物和探针(表1)均由生工生物(上海)股份有限公司合成㊂
1.4㊀病毒RNA的提取和cDNA合成
用TRIzol LS分别提取待检样品㊁疫苗株JXA1-R 和类NADC30毒株HNhx的总RNA，按照TRIzol LS 说明书，分别用TRIzol LS裂解样品，再用氯仿分离有机相和水相，异丙醇沉淀RNA,75%乙醇洗涤，最后用RNa free dH2O溶解，测定RNA浓度㊂按照PrimerScript RT Master Mix操作步骤，以20L的反转体系为准，反转录得到cDNA㊂
1.5㊀标准质粒的制备
根据疫苗株JXA1-R和类NADC30毒株HNhx 的Nsp2序列，利用表1中克隆引物JXA1-R和HNhx分别进行普通PCR扩增，连接到pMD20-T 载体，转化至JM109感受态细胞，挑选阳性重组克
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河南农业科学第50卷
隆，进行测序鉴定㊂构建的重组质粒测定浓度并计算拷贝数，作为荧光定量PCR的标准品㊂
表1㊀引物及探针序列
Tab.1㊀Sequences of primers and probes
引物/探针名称
Primer/probe name序列(5ᶄ 3ᶄ)
Sequence(5ᶄ 3ᶄ)产物大小/bp
Product size JXA1-R F:TGTCCTGGAAGAATATGGG307
R:GCAATCGGATCTGACCTT
JXA1-R-TaqMan F:AACTAACCAACACCCAGGCG86
R:CGGGTAGCTTTTGACCCAAG
JXA1-R-SYBR F:CTAACCAACACCCAGGCGAC85
R:GCGGGTAGCTTTTGACCCAA
JXA1-R-Probe FAM-CGACTTCAGAAATGATG-
GCCTGGGCGG-BHQ-1
HNhx F:GGTGGTTCCTTCCATTCTCC266
R:CTCTGCGGCAACGTCAAA
HNhx-TaqMan F:GCTGAAGCCGTCACCGATA75
R:TTCATTCCTCCCACCTGCTG HNhx-SYBR F:TGGGAGGAATGAACTTGGCG93
R:GGGGAGCCTCGTATTCAGTC
HNhx-Probe CY5-CGTCAACCCCTGTGCCCGCA-
CCAC-BHQ-2
1.6㊀标准曲线的建立
以10倍系列倍比稀释质粒标准品103~109拷贝/L，分别取2L作为荧光定量PCR的模板进行扩增，每个梯度设3个重复㊂对于探针法，经优化确定20L最佳反应体系:Premix Ex Taq(2) 10L,ROX Reference DyeⅡ(50)0.2L，引物0.6L，探针0.1L，模板2L,RNa free dH2O补至20L；反应条件:9520s;953s,6030s,40个循环㊂对于SYBR GreenⅠ方法，经优化20L反应体系:SYBR Green Master(2)10L，引物1L，模板2L,RNa free dH2O补至20L；反应条件:9510min;9515s,6045s,40个循环㊂使用ABI7500Fast Real-time PCR System进行荧光定量PCR检测，生成标准曲线㊂
1.7㊀敏感性试验
将质粒标准品按10倍倍比稀释，以每个稀释度的标准品为荧光定量PCR模板，同时设仅加水的阴性对照组，以确定建立方法可检测到的最低拷贝数㊂1.8㊀重复性试验
选取JXA1-R株和HNhx株不同拷贝数的标准品分别进行3组批内和批间重复，并计算批内和批间的标准差及变异系数，以评估建立方法的稳定性㊂1.9㊀特异性试验
以PEDV㊁SVA㊁PRV㊁PCV2㊁ASFV的基因组为模板，以JXA1-R株和HNhx株的cDNA为阳性对照，同时设仅加水的阴性对照，进行荧光定量PCR 检测，以检测建立方法的特异性㊂1.10㊀样品检测
所检血清样品来源于以下处理：将PRRSV阴性仔猪12头随机分为A㊁B㊁C3组,A组接种疫苗株JXA1-R,B组接种PBS,C组不做处理；仔猪7日龄
时,A组和B组均接种类NADC30毒株HNhx,C组不做处理㊂攻毒后15d，采集血清样品进行检测㊂2㊀结果与分析
2.1㊀荧光定量PCR标准质粒的制备
利用克隆引物经过PCR扩增分别获得Nsp2区JXA1-R株307bp和HNhx株266bp片段(图1)，将目国际形势
的基因片段连接到pMD20-T载体上，作为标准质粒对照㊂重组质粒经过测序鉴定，并测定其DNA含量:JXA1-R株为2244.32ng/L,HNhx株为2421.23ng/L，计算拷贝数后作为荧光定量PCR的标准品稀释使用
㊂
M:DNA Marker DL2000;1㊁2:JXA1-R株扩增产物;
3㊁4:HNhx株扩增产物;5:RNa free dH2O
M:DNA Marker DL2000;1,2:JXA1-R amplification products;
3,4:HNhx amplification products;5:RNa free dH2O
图1㊀标准质粒构建
Fig.1㊀Construction of standard plasmids
2.2㊀荧光定量PCR标准曲线的建立
将2.1中针对JXA1-R株和HNhx株的质粒标准品进行10倍系列稀释后作为模板，根据反应条件进行荧光定量PCR，生成扩增曲线和标准曲线(图2和图3)，对应的扩增曲线呈现出显著的S形，对应的标准曲线R2均达到0.990以上㊂
2.3㊀荧光定量PCR敏感性好习惯儿歌
试验
将针对JXA1-R株和HNhx株的质粒标准品进行10倍倍比稀释，使标准品浓度依次为101~1010拷贝/L，进行TaqMan荧光定量PCR检测，结果如图4所示㊂JXA1-R株和HNhx株的检出下限分别为104拷贝/L和103拷贝/L，对应的循环数分别约为33.67个和35.59个㊂根据阴性对照及3次重复试验结果，最终确定判定标准：对JXA1-R株，当循
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㊀第1期
㊀周新宇等：猪繁殖与呼吸综合征病毒类NADC30毒株与JXA1-R 疫苗株荧光定量PCR
鉴别检测方法的建立及应用A㊁B:JXA1-R 株扩增曲线㊁标准曲线;C㊁D;HNhx 株扩增曲线㊁标准曲线
A,B:Amplification curve and standard curve of JXA1-R;C,D:Amplification curve and standard curve of HNhx
图2㊀TaqMan 荧光定量PCR 方法的建立
Fig.2㊀Establishment of TaqMan real-time
PCR
A㊁B:JXA1-R 株扩增曲线㊁标准曲线;C㊁D:HNhx 株扩增曲线㊁标准曲线
A,B:Amplification curve and standard curve of JXA1-R;C,D:Amplification curve and standard curve o
f HNhx
图3㊀SYBR Green Ⅰ荧光定量PCR 方法的建立
Fig.3㊀Establishment of SYBR Green Ⅰreal-time PCR
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河南农业科学第50
卷
A:JXA1-R株;B:HNhx株
A:JXA1-R strain;B:HNhx strain
图4㊀TaqMan荧光定量PCR敏感性分析Fig.4㊀The nsitive assay of TaqMan real-time PCR
环数33小班课程故事
时，可以判定为阳性，当循环数34时，判定为阴性，当33<；循环数<34时，判定为可疑；对HNhx株，当循环数35时，可以判定为阳性，当循环数36时，判定为阴性，当35<；循环数<36时，判定为可疑㊂
将针对JXA1-R株和HNhx株的质粒标准品进行10倍倍比稀释，使标准品含量依次为101~108拷贝/L，进行SYBR GreenⅠ荧光定量PCR检测，结果如图5所示㊂JXA1-R株和HNhx株的检出下限均为102拷贝/L，对应的循环数分别约为36.34个和36.94个，此时阴性对照对应的循环数分别约为35.92个和36.02个㊂根据阴性对照及3次重复试验结果，最终确定判断标准：对于JXA1-R株和HNhx株，当循环数35时，可以判定为阳性，当循环数36时，判定为阴性，当35<；循环数<36时，判定为可疑㊂
2.4㊀荧光定量PCR方法的稳定性分析
将针对JXA1-R株和HNhx株的3份拷贝数不同的标准品进行3组批内和批间重复，根据循环数进行分析，其变异系数均小于1.5%(表2)，表明建立的Taq Man荧光定量PCR和SYBR GreenⅠ荧光定量PCR检测方法均具有良好的稳定性㊂
2.5㊀荧光定量PCR方法的特异性检测
利用建立的荧光定量PCR方法对PEDV和SVA的cDNA㊁PRV和PCV2的DNA㊁ASFV的质粒进行检测，结果如图6和图7所示㊂阳性对照出现特异性扩增，其他样品检测结果均为阴性，表明建立的方法具有良好的特异性㊂
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