Vol.41No.5May 2021
上海交通大学学报（医学版）
JOURNAL OF SHANGHAI JIAO TONG UNIVERSITY (MEDICAL SCIENCE)
细胞穿透肽Penetratin 修饰的眼用脂质体的构建与体外评价
徐
楠，张姝月，丁雪鹰
上海交通大学附属第一人民医院临床药学科，上海200080
［摘要］目的构建一种细胞穿透肽Penetratin 修饰的眼用脂质体（Penetratin-modified liposome ，Pen-Lip ），并初步评价其通过滴眼给
药治疗眼底新生血管疾病的适用性。方法通过二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-N-马来酰亚胺-聚乙二醇2000（DSPE-PEG 2000-Mal ）和Penetratin 的加成反应合成共聚物DSPE-PEG 2000-Pen ，再通过薄膜分散法制备Pen-Lip 。利用细胞摄取实验确定修饰脂质体的最佳Penetratin 比例。用纳米粒度电位仪测定P
en-Lip 的平均粒径、Zeta 电位和多分散系数（polydispersity index ，PDI ），用透射电子显微镜（transmission electron microscope ，TEM ）观察Pen-Lip 的形态。采用离心法测定Pen-Lip 装载康柏西普的包封率和载药量。将Pen-Lip 在PBS 或含50%胎牛血清PBS 中静置48h ，通过粒径变化和TEM 下形态考察Pen-Lip 的稳定性。采用CCK-8法检测Pen-Lip 对人源角膜上皮细胞（human corneal epithelial cell ，HCEC ）和人视网膜色素上皮细胞（human retinal pigment epithelium ，ARPE-19）的细胞毒性，利用激光共聚焦显微镜观察ARPE-19对Pen-Lip 的摄取情况。使用扩散池装置评估Pen-Lip 对离体兔角膜的渗透能力，计算表观渗透系数P app ，通过角膜水合值评价载有康柏西普的Pen-Lip 对角膜组织的毒性。结果修饰脂质体的最佳Penetratin 比例为3%。Pen-Lip 的平均粒径为（148.073.51）nm ，Zeta 电位为（5.660.91）mV ，PDI 为0.2270.045。TEM 结果显示其呈外表光滑的球形结构。Pen-Lip 的包封率为（44.063.70）%，载药量为（2.840.24）%。Pen-Lip 在PBS 和含50%胎牛血清PBS 中静置48h 后粒径无明显变化，TEM 显示分散均匀，表明其稳定性较好。在15~500g/mL 范围内时，Pen-Lip 对HCEC 、ARPE-19无明显细胞毒性。与未修饰脂质体相比，ARPE-19对Pen-Lip 的摄取能力显著提高（P =0.000）。离体兔角膜渗透实验中，Pen-Lip 的P app 显著大于未修饰脂质体（P =0.000）；载药Pen-Lip 处理后的离体兔角膜的水合值与未处理组相比差异无统计学意义（P >0.05）。结论Pen-Lip 在体外具有良好的稳定性、生物相容性、角膜透过能力，且能够被视网膜细胞摄取，是一种潜在的能够通过滴眼给药治疗眼底新生血管疾病的药物递送系统。
［关键词］细胞穿透肽；脂质体；康柏西普；眼底新生血管疾病；滴眼给药［DOI ］10.3969/j.issn.1674-8115.2021.05.006
［中图分类号］R944
［文献标志码］A
Cell -penetrating peptide Penetratin -modified liposomes for ophthalmic application:construction and in
vitro evaluation
XU Nan,ZHANG Shu -yue,DING Xue -ying
Department of Clinical Pharmacy,Shanghai General Hospital,Shanghai Jiao Tong University School of Medicine,Shanghai 200080,China
[Abstract ]Objective To prepare the cell-penetrating peptide Penetratin-modified liposome (Pen-Lip)for ophthalmic application and evaluate its applicability to treat fundus neovascularization dias through topical instillation.Methods The copolymer DSPE-PEG 2000-Pen was synthesized
by the addition reaction of DSPE-PEG 2000-Mal and Penetratin,and Pen-Lip was then prepared by the thin film dispersion method.The cellular uptake experiment was ud to determine the optimal ratio of Penetratin to modify liposomes.The average particle size,Zeta potential and polydispersity index (PDI)of Pen-Lip were characterized by the nano particle size potentiometer,and the morphology of Pen-Lip was obrved by using transmission electron microscope (TEM).The encapsulation efficiency and the drug loading of Pen-Lip with conbercept were determined by centrifugation.Pen-lip was incubated in the PBS or the PBS containing 50%fetal bovine rum for 48h and the stability of Pen-Lip was investigated by the change of particle size and the morphology under TEM.The CCK-8assay was conducted to detect the cytotoxicity of Pen-Lip to human corneal epithelial cell (HCEC)and human retinal pigment epithelium (ARPE-19),and the uptake of Pen-Lip by ARPE-19was obrved by using lar confocal microscope.The diffusion cell device was ud to detect the permeability of Pen-Lip through the isolated rabbit cornea,and the apparent permeability coefficient (P app )was calculated.The toxicity of Pen-Lip with conbercept to the corneal tissue was evaluated by the hydration value.Results The optimal ratio of Penetratin to modify liposomes was 3%.The average particle size of Pen-Lip was (148.073.51)nm,the Zeta potential was (5.660.91)mV,and the PDI was 0.2270.045.TEM results showed that Pen-Lip had a smooth spherical structure.The encapsulation efficiency of Pen-Lip was (44.063.70)%,and the drug loading
was (2.840.24)%.The particle size of Pen-Lip did not change significantly and TEM showed uniform dispersion after dispersing in the PBS or the PBS containing 50%fetal bovine rum for 48h,exhibiting the good stab狮子座女和什么座最配
ility of Pen-Lip.When Pen-Lip was at the concentration of 15‒500g/mL,Pen-Lip had no cytotoxicity to HCEC and ARPE-19.Compared with unmodified liposomes,ARPE-19cells had significantly higher uptake of Pen-Lip (P =0.000).
[基金项目]松江区科技攻关项目（18sjkjgg ）；嘉兴市肿瘤光动力靶向药物研究重点实验室。[作者简介]徐楠（1995—），女，硕士生；电子信箱：******************。[通信作者]丁雪鹰，电子信箱：*******************。
[Funding Information ]Key Science and Technology Program of Songjiang District (18sjkjgg);Jiaxing Key Laboratory of Oncological Photodynamic Therapy and Targeted Drug Rearch.
[Corresponding Author ]DING Xue-ying,E-mail:*******************.
[网络首发]htt关于绘画的名言
ps:///kcms/detail/31.2045.R.20210429.1854.019.html (2021-04-3014:18:58)。
论著基础研究
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In the experiment of rabbit cornea penetration in vitro,the P
app
of Pen-Lip was significantly higher than that of unmodified liposomes(P=0.000).There was no statistically significant difference in the hydration value of the rabbit cornea treated with drug-loaded Pen-Lip compared to the untreatd group(P> 0.05).ConclusionPen-Lip has goo顶岗实习个人总结
d stability,biocompatibility and corneal permeability in vitro and can be taken up by retinal cells,which is a potential ocula叠用
r drug delivery system to treat fundus neovascularization dias through topical instillation.
[Key words]cell-penetrating peptide(CPP);liposome;conbercept;fundus neovascularization dia;topical instillation
眼内新生血管性疾病主要位于眼后段，如年龄相关性黄斑变性（age-related macular degeneration，AMD）和糖尿病视网膜病变（diabetic retinopathy，DR），被认为是导致不可逆视力丧失和失明的主
要原因［1］。临床治疗眼底新生血管的主要方式是玻璃体腔注射生物药物，如血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）受体融合蛋白康柏西普（conbercept，Conb）［2］、阿柏西普［3］等，推荐疗程为初始3个月每月给药1次，之后每3个月给药1次。玻璃体腔注射是一种侵入性较强的给药方式，反复注射导致患者依从性差，且容易引发一些眼部并发症，如白内障形成、高眼压、视网膜脱离［4］、玻璃体出血和组织损伤等［5］。因此临床亟需一种安全有效、使用方便、患者依从性高的给药方案治疗眼底新生血管疾病。
现有相关文献［6-8］报道，滴眼给药可作为玻璃体腔注射治疗眼底疾病的替代方案。与小分子药物相比，生物药物分子量大，亲水性强，角膜上皮和泪膜等生物屏障阻碍了药物渗透，导致到达眼底的药物浓度很低。改善滴眼所给药物对眼部屏障的透过性是目前亟需攻克的难题。细胞穿透肽（cell-penetrating peptide，CPP）是由几个或十几个氨基酸残基组成的多肽，具有将多种大分子物质递送入细胞的能力，如树枝状聚合物［9］、脂质体（liposome）［10］、胶束［11］和蛋白质［12］等。Penetratin是一种源于果蝇触角基因同源结构域的CPP，可通过滴眼给药到达眼后部视网膜，其角膜穿透能力是对照肽的87.5倍，是其他CPP的16~31倍［13］，在眼部渗透性和生物相容性方面表现出优异的性能。
脂质体由包裹在水相周围的磷脂双分子层组成，成分与细胞膜相似，可增强药物的角膜渗透能力。Cheng 等［14］研究发现壳聚糖包衣脂质体滴眼液可有效穿透角膜治疗视网膜黄斑水肿，Lai等［15
］发现脂质体滴眼给药后可有效改善大鼠光氧化性视网膜损伤。脂质体载药性能优良、生物相容性高、易于表面修饰、临床转化性强，是一种很有前景的眼部药物载体。目前尚未见Penetratin 修饰的脂质体（Penetratin-modified liposome，Pen-Lip）滴眼给药治疗眼后部疾病的报道。本研究构建了一种眼用Pen-Lip，并对其理化性质和体外行为进行了表征及评价，以期实现非侵入性治疗眼底新生血管疾病。1材料和方法
1.1主要试剂与仪器
Penetratin［（HS-）CRQIKIWFQNRRMKWKK］购自上海强耀生物科技有限公司，蛋黄卵磷脂（egg phosphatidylcholine，ePC）、胆固醇（cholesterol，chol）、二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-N-马来酰亚胺-聚乙二醇2000（DSPE-PEG
2000
-Mal）、二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二
醇2000（DSPE-PEG
2000
）
购自上海艾伟特医药科技有限公司，Conb眼用注射液购自成都康弘药业集团股份有限公司，DMEM/F12培养基、MEM培养基、胎牛血清（fetal bovine rum，FBS）、青霉素-链霉素溶液（双抗）、非必需氨基酸（non-esntial amino acidssolution，NEAA）购自美国Gibco公司，人IgG ELISA试剂盒购自武汉伊莱瑞特生物科技股份有限公司，CCK-8试剂盒购自上海翊圣生物科技有限公司。绿色荧光蛋白（green fluorescent protein，GFP）、尼罗红（Nile red，Nr）染料购自北京索莱宝科技有限公司。其他试剂均为分析纯。
旋转蒸发仪购自上海大研仪器有限公司，Zetasizer ZS90型纳米粒度电位仪购自英国Malvern公司，JEM-2010型透射电子显微镜（transmission electron microscope，TEM）购自日本JEOL公司，低温高速冷冻离心机购自德国Eppendorf公司，DMIL荧光显微镜购自德国Leica公司，激光扫描共聚焦显微镜购自日本Olympus公司，超净工作台购自淀山湖净化设备仪器厂，MS-H-PRO磁力搅拌器购自大龙兴创实验仪器有限公司，MULTISKANMK3酶标仪购自美国Thermo公司。
1.2细胞株与细胞培养
人源角膜上皮细胞（human corneal epithelial cell，HCEC）购自北京北纳创联生物技术研究院，人视网膜色素上皮细胞（human retinal pigment epithelium，ARPE-19）由上海市第一人民医院孙晓东课题组馈赠。
HCEC在含有15%FBS、1%双抗、1%NEAA的MEM 培养基中培养，ARPE-19在含有10%FBS、1%双抗的
DMEM开方符号
/F12培养基中培养，均置于条件为37℃，5%CO
2的培养箱中。定期在显微镜下观察细胞生长情况。待细胞生长融合度达80%时进行传代，传至第3~8代时进行
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徐楠，等细胞穿透肽Penetratin 修饰的眼用脂质体的构建与体外评价
细胞实验。1.3
DSPE-PEG 2000-Pen 共聚物的合成
DSPE-PEG 2000-Pen 由DSPE-PEG 2000-Mal 的马来酰亚胺基团和Penetratin 半胱氨酸残基上的巯基通过1，4加成反应所得［16］。将DSPE-PEG 2000-Mal 和Penetratin 溶解于氯仿中，滴加三乙胺作为催化剂，轻轻振摇。该混合溶液在
充氮条件下于室温避光反应24h ，然后进行过滤，所得滤液通过旋转蒸发仪进行蒸发得到固体结晶。固体结晶用氯仿重新溶解后过滤，再次通过旋转蒸发仪蒸发进行纯化操作八旗羊汤
。产物于-20℃下储存直至使用。合成原理如图1所示，碱催化剂夺取半胱氨酸巯基上的活泼氢，硫负离子进攻不饱和酮的位，经1，4共轭加成和酮式烯醇式互变异构过程，定量地生成C-S-C 偶联产物。
1.4脂质体的制备
空白脂质体（Lip ）通过薄膜分散法制备［17］。称取
10.0mg ePC 、2.5mg Chol 、3.0mg DSPE-PEG 2000溶解于装有二氯甲烷和甲醇（体积比为2∶1文化堕距
）混合溶液的试管里，并转移至茄型瓶中；使用旋转蒸发仪在35℃条件下进行减压蒸发除去有机溶剂，瓶壁上可形成一层均匀的脂质薄膜；继续真空干燥2h 除去残余的有机溶剂。将10mL PBS 溶液（0.1mmol/L ，pH 7.4）加入茄型瓶中，快速振荡，使PBS 溶液与脂质薄膜发生水合作用；然后在冰上进行水浴超声使脂质薄膜从瓶壁上完全脱落，继
续避光搅拌１h ；得到的乳白色液体先后通过0.45m 、0.22m 微孔滤膜进行过滤，重复3次后获得粒径合适的Lip ，4℃避光保存备用。
Pen-Lip 制备方法同上，区别在于将DSPE-PEG 2000替换为DSPE-PEG 2000-Pen 。Lip/GFP 、Pen-Lip/GFP 、Lip/Conb 、Pen-Lip/Conb 的制备方法同上，区别在于将水合介质PBS 溶液替换为含GFP 或Conb 的PBS 溶液。Nr 标记的脂质体制备方法同上，在旋转蒸发之前加入适量Nr 于有机试剂中，重复后续步骤即得到Lip/Nr 、Pen-Lip/Nr 。上述脂质体制备完成后均于4℃
避光保存备用。
图1DSPE-PEG 2000-Pen 共聚物的合成示意图
Fig 1Schematic diagram of synthesis of copolymer DSPE-PEG 2000-Pen
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1.5Penetratin修饰比例的确定
通过细胞摄取实验来确定修饰脂质体的最佳
Penetratin修饰比例［18］。将HCEC按2105/孔的密度接种
于12孔细胞培养板中，在培养箱中培养24h后用PBS润
洗2遍，将1%、3%、5%Pen（DSPE-PEG
2000
-Pen浓度分
别1%、3%、5%）修饰的Pen-Lip/Nr溶液加入12孔板中。
细胞与Pen-Lip/Nr孵育4h后，用含1000IU/mL肝素的
PBS于冰上洗涤3次，去除细胞外结合的Pen-Lip/Nr，将
细胞浸泡在每孔1mL的PBS中，并立即使用倒置荧光显
微镜系统观察细胞对于Pen-Lip/Nr的摄取情况。用Image
J软件对平均荧光强度进行半定量分析。
1.6脂质体的表征检测
取100L新鲜制备的Lip、Pen-Lip溶液，稀释10倍后
放入测量池中，用动态光散射粒径分析仪分析测定平均粒
径、Zeta电位和多分散系数（polydispersity index，PDI）。
用TEM观察Pen-Lip的形态。镊子小心夹着覆有碳支
持膜的铜网，用吸管吸取新鲜制备的Pen-Lip溶液，滴1滴
样品至铜网上；滴液后静置数分钟，无残留液体时滴加负
染色液进行染色；吸去多余染料，待铜网自然干燥后即可
置入电镜中观察，设加速电压为75kV，观察并拍照。
采用离心法［17］间接测定包封率和载药量。将新鲜制
备的Lip/Conb、Pen-Lip/Conb进行离心（4℃，11250g，
20min），上清液用0.45m微孔滤膜过滤，通过ELISA
试剂盒来测定上清液中Conb的浓度。根据以下公式计算
包封率和载药量：
包封率=投入的药物总质量-上清液中药物的质量
投入的药物总质量
100%，
载药量=投入的药物总质量-上清液中药物的质量
载药脂质体的总质量
100%。
1.7稳定性研究
为了考察脂质体在常规条件和生理条件下的稳定性，分别以PBS、含50%FBS的PBS为介质并测定不同时间点Lip、Pen-Lip的椰树叶
粒径大小。将新鲜制备的Lip、Pen-Lip分散在PBS溶液或含50%FBS的PBS溶液中，在预定的时间点（0h、1h、2h、4h、8h、24h、48h）取样测定脂质体的平均粒径，并在48h后取样拍摄电镜图。
1.8细胞毒性考察
采用CCK-8法对Lip、Pen-Lip的细胞毒性进行考察。将HCEC、ARPE-19细胞按5103/孔的密度接种于96孔细胞培养板中，在培养箱中培养24h后将Lip、Pen-Lip用无血清培养基稀释成浓度为15、30、60、120、250、500g/mL的溶液加入96孔板中。孵育24h后用PBS洗涤3次，加入100L含10%CCK-
8试剂的培养基，放入培养箱中孵育1h。用酶标仪测定各孔在450nm处的吸光度值并计算各浓度处理下的细胞存活率。
1.9细胞对脂质体摄取情况的检测
在24孔板中预先铺上无菌的圆形盖玻片，将ARPE-19细胞按5104/孔的密度接种在盖玻片上，在培养箱中培养24h后，换无血清培养液培养过夜。用PBS润洗2遍后，将含有Nr染料、Lip/Nr或Pen-Lip/Nr的无血清培养基加入24孔板中。37℃孵育3h后，用含1000IU/mL肝素的PBS于冰上洗涤3次，去除细胞外结合的Nr染料、Lip/Nr或Pen-Lip/Nr。用预冷的4%多聚甲醛固定30min，PBS洗涤3次。吸取10L含DNA结合染料DAPI的抗荧光淬灭封片液滴在载玻片上，小心取出盖玻片，将有细胞的一面贴在滴有封片液的载玻片上，避光放置30min。使用激光扫描共聚焦显微镜观察细胞对于脂质体的摄取情况。
1.10离体渗透性和组织毒性检测
使用扩散池装置测定Pen-Lip/GFP通过离体兔角膜的渗透性。扩散孔的内径为10mm，扩散面积为0.785cm2。通过耳缘静脉注射致死剂量的戊巴比妥钠处死家兔，摘除眼球，小心地将角膜（连同周围约2mm宽度的巩膜）从眼球中取出，用PBS轻轻冲洗。将角膜水平放置在供体室与受体室之间，使角膜上皮表面面向供体溶液，用夹子固定。扩散池中的溶液通过循环加热系统预热并保持在34℃，磁力搅拌速度为100r/min。供体液分别为3mL GFP、Lip/GFP、Pen-Lip/GFP（GFP浓度为5mg/ mL），受
体液为等体积PBS溶液，排尽气泡使角膜组织与受体液充分接触。在4h内，每隔0.5h从受体室中吸取100L样品，然后立即补充等量的PBS。使用酶标仪检测提取样品中GFP的浓度，并使用如下公式计算相应的表观渗透系数P
app
（cm/s）：
P
app
=
Q
tc
A3600。
其中Q/t是GFP浓度随时间的变化，由渗透曲线线性
部分的斜率表示；c
表示GFP的初始浓度；A表示扩散装置的扩散面积；3600为换算因子。
使用相同装置和方法检测Pen-Lip/Conb对离体角膜的渗透性，供体液分别为3mL Conb、Lip/Conb、Pen-Lip/ Conb（Conb浓度均为1mg/mL），受体液为等体积PBS溶液，用ELISA试剂盒检测提取样品中Conb的浓度。在渗
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徐楠，等细胞穿透肽Penetratin 修饰的眼用脂质体的构建与体外评价
透性实验后通过角膜水合值（hydration value ，H ）初步评价脂质体对角膜组织的毒性。从扩散装置中取出角膜，将周围的巩膜组织去除，精确称量每个角膜组织，质量记为m 0，在65℃下烘干48h 后再次称量，质量记为m 1，并按照如下公式计算水合值：
H =
m 0-m 1
m 0
100%。
1.11统计学分析
使用GraphPad Prism 7进行统计学分析。定量资料用
x s 表示，组间比较采用单因素方差分析。P <0.05认为差异具有统计学立志的诗句
意义。
2
结果
2.1
Penetratin 修饰的最佳比例
为了确定脂质体修饰所需的最佳Penetratin 比例，
通过细胞摄取实验评估了不同比例Penetratin 修饰的脂
质体被细胞摄取效率，用平均荧光强度大小来表示摄取效率高低。如图2所示，3组的平均荧光强度分
别为27.571.28、35.531.12、27.340.77，当用3%Pen 修饰脂质体时，平均荧光强度最高，与1%Pen 、5%Pen 修饰组差异有统计学意义（均P =0.000），表明该比例修饰组被细胞摄取效率最高。后续制备时均使用3%Pen 修饰脂质体。
2.2脂质体的表征
Lip 的平均粒径为（143.872.49）nm ，PDI 为0.241
0.021；Pen-Lip 的平均粒径为（148.073.51）nm ，PDI 为0.2270.045，呈正态均匀分布（图3A ）。表明Lip 表面修饰Penetratin 对粒径大小没有显著影响，脂质体颗粒分散性良好。Lip 和Pen-Lip 的Zeta 电位分别为-（3.170.55）mV 和（5.660.91）mV 。未修饰时Lip 的Zeta 电位为负值，
对Lip 进行表面修饰后，由于Penetratin 带正电荷，Pen-Lip 的Zeta 电位变为正值。TEM 拍摄结果如
图3B 所示，可以看出Pen-Lip 呈外表光滑的球形结构。通过ELISA 检测得到Lip 的包封率为（40.473.46）%，载药量为（2.610.22）%；Pen-Lip 的包封率为（44.063.70）%，载药量为（2.840.24）%，修饰前后包封率和载药量差异无统计学意义（P >0.05）。
2.3脂质体的稳定性
图4A 是不同时间点的脂质体粒径大小，可以看出
Lip 和Pen-Lip 在PBS 和含50%FBS 的PBS 溶液中静置48h
后，平均粒径变化不大，基本维持其原本粒径大小，TEM 结果（图4B ，C ）显示Lip 、Pen-Lip 静置48h 后分
散均匀，没有发生聚集，稳定性较好。
Note ：A.Fluorescence microscope images of Pen-Lip taken by cells.B.Mean fluorescence intensity.①P =0.000,compared with the 3%Pen group.图2不同比例Penetratin 修饰脂质体被细胞摄取情况的比较
Fig 2Comparison of cellular uptake of different proportions of Penetratin modified
liposomes
图3Pen-Lip 的粒径分布图（A ）和TEM 图像（B ）
Fig 3Particle size distribution (A)and TEM image of Pen-Lip (B)
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