基因组学XXX

基因组学XXX

⼀、基因组概况

1.1 基因组的概念

.基因组：⼀个物种的全套染⾊体和基因

基因组学：研究基因组及其基因的科学

分为结构基因组学、功能基因组学、⽐较基因组学等

1.2 模式⽣物：受到⼴泛研究，对其⽣物现象有深⼊了解的物种

原因：具有代表性、易获得、遗传背景清晰、容易研究、时代短、⼦代多

种类：⼤肠杆菌、酵母、果蝇、线⾍、⼩⿏、斑马鱼、拟南芥、⽔稻

⼆、基因组遗传图谱的制作

1.1 基因组测序的策略

1.鸟枪法：将基平面拍摄 因组打断成⼩⽚段，然后连接到载体上构建⽂库进⾏测序，通过计算机软件搜索重叠区从⽽获得主序列。

2.克隆重叠群法：将基因组打断成许多⽚段，建⽴重叠群，对每⼀短发波波头 ⽚段进⾏鸟枪法测序后再利⽤计算机软件拼接成主序列。

重叠群：相互存在重叠序列的⼀组克隆DNA

1.晋升制度 2 遗传图谱

1.遗传标记

形态标记：能够明确显⽰遗传多样性的外观形状及其对应等位基因

数量有限，受环境影响

细胞学标记：能明确显⽰遗传多样性的细胞学特征（染⾊体结构和数量特征）

花费⼤量⼈⼒物⼒

蛋⽩质标记

DNA分⼦标记：DNA⽔平上的遗传多态性

共显性遗传：杂合⼦能同时出现两个等位基因的表型

分⼦标记

1 RFLP:限制性⽚段长度多态性

由于限制性酶切位点或位点之间的区段发现突变造成的长度发⽣改变的酶切⽚段

2 STS标记

根据染⾊体上单拷贝DNA两端设计引物，PCR扩增得到的具有长度多态性的产物

3 SSLP 简单序列长度多态性

⼀系列不同长度的重复序列，分为两类

⼩卫星（VNTR）：重复单位为⼏⼗个核苷酸【Southern blot】

微卫星（SSR）：重复单位为⼏个核苷酸【PCR扩增】

4 ISSR

PCR扩增两个SSR之间的⼀段DNA序列，观察其长度多态性

5 SNP 单核苷酸多态性

基因组中存在的数量极⼤的单个碱基的突变

只有两种等位性，是双等位性分⼦标记，在⼀个个体中常常以纯合状态存在

SSR具有遗传稳定性

6 其他分⼦标记

RAPD:9-10个碱基的随机引物对基因组进⾏PCR扩增，检测基因组的多态性

AFLP：对基因组酶切⽚段的选择性扩扩增来检测DNA酶切⽚段长度多态性

CAPS：当SCAR或STS扩增产物没有表现长度多态性，⽤限制性内切酶对扩增产物

3.遗传作图的原理

利⽤遗传三⼤定律（等位分离、⾃由组合、连锁交换）与分⼦标记来建⽴染⾊体上标记定位的谱图。

4.遗传图谱的构建

选择合适的分⼦标记

选择合适的亲本

建⽴分离群体

测定不同个体的标记基因型

对标记基因型数据进⾏连锁分析，构建标记连锁图

5.分⼦标记辅助选择

如果⽬标基因与某个分⼦标记紧密连锁，通德马拉 过对分⼦标记基因型的检测，就可以获知⽬的基因的基因型。

分类：

前景选择：通过分⼦标记选择⽬标基美人电影韩国 因

背景选择：通过分⼦标记选择除了⽬标基因以外的整个基因组

三、物理图谱

1.概念：采⽤分⼦⽣物学技术直接将DNA分⼦标记、基因或克隆标记定位基因组的实际位置。

2.限制性酶切作图：将限制性酶切位点定位在染⾊体的相对位置上。

3.基于克隆的作图：利⽤克隆重叠群来定位图谱。

克隆重叠群的组建⽅法：染⾊体步移、指纹作图

克隆指纹：⼀个DNA样品所具有的特定DNA⽚段组成。如果两个克隆有指纹重叠，则证明他们共同序列。

4 荧光标记原位杂交：利⽤染⾊体不同区段对荧光烤肉配方 染料亲和⼒不同的特性将染⾊体染成不同的区带。

四、基因组测序

测序的⽅法

1 传统⽅法：化学降解法

双脱氧终⽌法

⾃动化测序：将四种ddNTP⽤四种不同的荧光染料标记，与模板，引物，dNTP混合开始延伸新链，在同⼀泳道进⾏⽑细管电

泳，延伸⽚段按长度⼤⼩依次通过荧光信号检测器，从⽽获取测序信号

焦磷酸测序：每轮反应中按A,T,C,G的顺序只加⼊⼀种dNTP,如果DNA新链上每多合成⼀个新碱基，就会释放出⼀个焦磷酸，

焦磷酸在4种酶的协同作⽤下释放⼀次荧

光信号。根据最终获得的峰值图获取DNA序列。

DNA芯⽚测序：将各种排列的寡核苷酸排列在芯⽚上，待测DNA与芯⽚杂交后，凡是能杂交的位置都会发出信号（芯⽚上的

寡核苷酸长度⽐测序长度短，⽽且只有完全互补配对才能发出信号），将所有可以发出信号的核苷酸序列进⾏⽐对，拼接出完

整的DNA序列。

2 新⼀代⾼通量测序技术

Solexa 边合成边测序

1.打断基因组DNA，装上接头

富集模板 2.双链变性成单链后使其随机散落到芯⽚上

3.由于芯⽚上有许多接头，DNA形成桥式结构与以芯⽚上的接头为引物⼤量扩增单链模板

4.合成新链并同时测序：每⼀轮反应加⼊带有四种荧光标记的dNTP,末端带有阻断基团，不能使下⼀个碱基连接上去，阻断基

团可以除去

5.仪器读取相应的荧光信号

6.化学⽅法去除阻断基团，进⾏下⼀轮反应

454 油包⽔⼩磁珠平⾏反应

1.打断基因组DNA，连上接头后变性⽣成单链DNA

2.单链DNA与磁珠混合，退⽕后每个磁珠只与⼀个单链DNA结合，加⼊矿物油和表⾯活性剂，震荡后形成油包⽔乳浊液。每

个油包⽔独⽴体系中仅含⼀个磁珠与⼀个PCR反应体系，扩增得到⼤量单链模板DNA

3.将磁珠放在⼀个平板上，平板上有许多⼩孔，每个⼩孔仅容纳⼀个磁珠

4.利⽤焦磷酸测序法测定DNA序列

Solid 两碱基测序

3 深度测度与重测序

测序深度：测序得到的碱基总量与基因组碱基总量的⽐值，测序深度与基因组覆盖率是⼀个正相关的关系。

重测序：对基因组序列已知的物种进⾏不同个体的基因组测序，并在此基础上对个体或总群进⾏差异性分析。

4.2 物理间隔与顺序间隔

物理间隔：建库时由于载体和宿主菌选⽤不当⽽丢失的序列

顺序间隔：测序时遗漏的序列，挑选阳性克隆解决

4.3 四种cDNA⽂库

1.特异cDNA ⽂库：某物种内特殊组织或细胞在特定的时空所有的mRNA转录形成的⽂库。

2.平衡化cDNA⽂库：由于mRNA存在⾼、中、低三种不同的表达丰度，为了获得更多基因信息尤其是低丰度表达的信息，采

⽤这⼀⽅法建库。

平衡化的⽅法:

1 基因组DNA饱和杂交：基于基因组DNA在拷贝数上具有相对均⼀化的性质，通过将cDNA与基因组DNA饱和杂交从⽽降低

⾼拷贝cDNA的丰度

2 基于复性动⼒学原理：⾼丰度cDNA在退⽕条件下复性快，低丰度cDNA慢，故可以通过控制复性时间来控制丰度。

3.扣除cDNA⽂库

关注与对照相⽐表达有上升或下降的基因

4.全长cDNA⽂库

产⽣⾮全长cDNA⽂库的原因：

分离的mRNA不完整，合成cDNA第⼀条链时反转录酶从末端滑落

产⽣全长cDNA的三种⽅法：

技术（基因操作原理）

-trapper法

完整的mRNA5’和3’端末位核苷酸上均有两委婉表白 个羟基，能够被氧化为醛基从⽽与⽣物素结合。合成了cDNA第⼀条链后，⽤

Rna A（降解单链RNA）来处理杂合双链，如果合成的cDNA不完整，Rna A会降解mRNA5’端，因此全长cD熏鱼怎么做好吃 NA带有⽣

物素⽽⾮全长cDNA不带有⽣物素，通过此来筛选全长cDNA.

-capping法

完整的mRNA5’有帽⼦结构⽽⾮完整的mRNA5’没有。如果⽤碱性磷酸酶对mRNA5’进⾏处理，完整的mRNA没有变化⽽⾮完

整的mRNA5’磷酸基团被除去。在⽤TAP处理去掉完整mRNA的帽⼦结构，从⽽暴露出磷酸基团。⽤末端转移酶给其5’添加⼀

个碱基作为引物延伸cDNA的第⼀条链。