高效液相色谱串联质谱法检测西地那非血浆浓度

高效液相色谱串联质谱法检测西地那非

血浆浓度

目的：建立高效液相色谱串联质谱法测定人血浆中西地那非的浓度。

方法：以西地那非-d为内标，血浆经甲醇沉淀蛋白后，采用Titank-C18色

8

谱柱分离，流速0.5 mL/min；以选择反应检测（SRM）方式进行检测。

结果：西地那非的线性范围为4.00ng/mL~1000 ng/mL，提取回收率和内标平

均提取回收率分别为82.32%～84.75%和99.69%，日内和日间准确度精密度均＜

15%。

结论：本法操作简便、快速、灵敏，重现性好，适应于西地那非人体内血药

浓度的测定及其药代动力学和生物等效性研究。

关键词：西地那非；高效液相色谱串联质谱法；含量测定

西地那非是一种5型磷酸二酯酶（PDE5）抑制剂，PDE5在阴茎海绵体中高度

表达。当性刺激引起局部一氧化氮（NO）释放时，一氧化氮激活鸟苷酸环化酶，

导致环磷酸鸟苷（cGMP）水平增高，使海绵体平滑肌松弛，血液流入而使阴茎勃

起。西地那非对人海绵体无直接松弛作用，通过选择性抑制PDE5，升高环磷酸鸟

苷（cGMP）水平高而导致阴茎海绵体平滑肌松弛，从而对阴茎血流水平进行调控。

西地那非临床上用于治疗勃起功能障碍（ED），能安全有效的改善各种ED患者

的勃起功能。

[1]

西地那非口服后吸收迅速，10～40min起效，绝对生物利用度约为40%。空

腹口服30～120min后达血药浓度峰值（Cmax），餐后口服90～180min达Cmax。

本文建立HPLC-MS/MS法测定人血浆中西地那非的浓度，采用甲醇蛋白沉淀

法，简单，快速，稳定，可同时满足临床药代动力学及生物等效性研究中大批量

样品分析的要求。

1. 仪器与对照品

Thermo TSQ Altis 三重四级杆质谱仪；Vanquish UHPLC超高效液相。枸橼

酸西地那非来源：中国食品药品检定研究院，批号：420012-202003；西地那非-

d来源：TLC，批号：1390-029A2。

8

1. 方法

1. 液相色谱-质谱条件

1. 色谱条件：色谱柱为Titank C18 5m 50x2.1mm；流动相

5mM乙酸铵溶液（A）和乙腈溶液（B）；流速0.5mL/min；

梯度洗脱程序为0minA：B（80:20）→2.5minA：B（90:10）

→3.4minA：B（90:10）→3.5minA：B（80:20）→3.5min A：

B（80:20）(stop)，0.8min质谱切入，3min质谱切出；柱

温35℃；进样量2L。

2. 质谱条件：ESI（电喷雾离子源），正离子检测模式，其中离

子化电压3500V，鞘气60Arb，辅助气15Arb，尾吹气2Arb，

离子传输管温度380℃，蒸发器温度350℃，选择反应检查

（SRM）方式定量，西地那非m/z 475.30→283.19，西地那

非-d

8

m/z 483.37→283.19。

2. 溶液的配制

1. 对照品溶液：精密称取枸橼酸西地那非对照品，用适量的甲

醇溶解，配制成浓度为1mg/mL的储备液（使用校正因子），

再使用甲醇将西地那非配置成为200ng/mL（LLOQ水平）、

400 ng/mL、1000 ng/mL、4000 ng/mL、12500 ng/mL、

30000 ng/mL、45000 ng/mL、50000 ng/mL的工作溶液，

以及浓度为定量下限（LLOQ，200 ng/mL），低浓度（LQC，

600 ng/mL），几何中浓度（GMQC，3000ng/mL），中浓

度（MQC，25000 ng/mL），高浓度（HQC，40000 ng/mL）

的质qos类型 控溶液。

2. 内标溶液：将西地那非-d

8

对照品用适量的甲醇溶解，配制

成浓度为4mg/mL的内标溶液（使用校正因子）。移取

200L该溶液加入至600L甲醇中，配制成浓度为1.00

mg/mL的内标储备液储备液。使用适量的甲醇将内标储备

液稀释至20.0 g/mL作为内标工作溶液。

3. 样品前处理：移取100 L血浆样品（空白样品和内标空白样品加

100L空白血浆），加入10.0L IS-C（西地那非-d 500 ng/mL）

8

溶液（空白样品加入10.0L甲醇溶液）。分别加入390 L的0.5%

氨水甲醇溶液，将样品涡旋 5分钟后，在 4000 rpm、4C 条件下离

心5分钟，用移液工作站移取上清液150L，使用150L的含0.5%

氨水[甲醇：水（1：3）]溶液稀释，涡旋 5 什么的朝霞 分钟，在 4000 rpm、

4C条件下离心5分钟，交由 LC-MS/MS 分析。

4. 标准曲线和线性范围：取空白血浆490 L，加入10.0 L的西地那

非工作溶液，得到浓度为4.00 ng/mL、8.00 ng/mL、20.0 ng/mL、

80.0ng/mL、250 ng/mL、600 ng/mL、900 ng/mL、1000 ng/mL

的血浆样品，按照前处理方法进行提取。对理论浓度与响应值（待

测物与内标峰面积比值）进行线性回归，采用最小二乘法对标准曲

线所有浓度点进行拟合，权重因子为1/x，其在整个方法验证中须

2

保持一致。

5. 准确度与精密度：取空白血浆490 L，加入10.0 L的西地那非质

控溶液，得到浓度为4.00ng/mL（LLOQ）、12.0ng/m（LQC）、

60.0ng/mL（GMQC）、500ng/mL（MQC）、800ng/mL（HQC）

的质控血浆样品，按照前处理方法进行提取。在3批连续独立的验

证分析批考察质控样品（包括LLOQ、LQC、GMQC、MQC和HQC 5

个浓度水平，每浓度水平 6 个重复样品，至少分两天进行），评估

批间的准确度和精密度。

6. 选择性：空白基质对待测物与内标的干扰：通过测试6个不同来源

（批次）的不添加待测物和内标的空白基质样品（各1个重复）进

行评估；待测物对内标的干扰：通过测试混合空白生物基质中只添

加待测物（不添加内标）的定量上限（ULOQ）浓度水平的样品进

行评估（1个重复）；内标对待测物的干扰通过测试6个不同来源

（批次）的空白基质中只添加内标（内标浓度为常规样品中内标浓

度水平）不添加待测物的样品（各1个重复）、1 个混合基质内标

空白样品进行评估。

7. 基质效应：使用至少6 个不同来源的单个空白基质来考察内标及待

测物低、高浓度水平下（LQC、HQC）的基质效应。

8. 溶血效应：使用4个不同来源的单个空白基质配制溶血质控样品来

考察溶血在低、高浓度水平下（LQC、HQC）对待测物检测结果的

影响。

9. 高脂效应：使用至少 4 个不同来源的高脂血浆配制高脂质控样品来

考察高脂在低、高浓度水平下（LQC、HQC）对待测物梦到吃玉米 检测结果的

影响。

10. 提取回收率：6 15的英文 个重复的LQC、MQC、HQC与18个混合空白生物

基质样品一同处理。处理后，将含有待测物和内标的溶液加入空白

样品中，以使其最终浓度与高、中、低质控样品的进样浓度一致。

11. 残留：在定量上限样品之后进样分析空白基质样品，评估系统残留。

空白样品中待测物/内标的峰面积均值应不超过该分析批有效定量

下限标准曲线样品峰面积响应均值的20.0%（对于待守宫怎么养 测物），5.0%

（对春声 于内标）。

12. 稳定性试验：考察了西地那非储备液与定量下限在室温黄光条件下

20小时的溶液稳定；低、高浓度质控血浆样品在黄光冰浴条件下

18小时的短期稳定性；低、高浓度质控血浆样品在-20C和-80C

条件下的4次冻融稳定性与放置41天的长期稳定性；人全血高、

低浓度质控样品在黄光冰浴下放置2小时后的稳定性；4℃避光条

件下放置68小时的制备后样品稳定性。

2. 结果与讨论

色谱图由 Chromeleon(c) Dionex 软件 7.2.6 版自动采集。用分析物和内

标的峰面积比和标准样品的浓度来建立标准曲线，得到线性回归方程（使用加权

最小二乘法同学用英语怎么说 ，权重因子 1/x），软件自动计算浓度。

2

西地那非的定量范围为4~1000 ng/mL，满足方法验证甘蔗英文 的相关接受标准，批间

准确度偏差在-4.53%和3.26%之间，批间精密度在2.06%和3.60%之间。质控样品

批内准确度偏差在-3.89% 到2.13% 之间，批内精密度在1.12% 到4.96% 之间，

批间准确度偏差在-2.20% 到-0.89% 之间，批间精密度在2.25% 到4.04% 之间。

西地那非的准确度和精密度均满足相应接受标准。

[2]

不同来源的基质西地那非的测定不存在干扰，且西地那非以及内标之间也不

存在相互干扰，人血浆中西地那非和内标化合物的测定不受生物基质的影响；本

方法未见显著进样残留。西地那非高、中、低 3 个浓度质控样品的平均提取回

收率为84.7女性尿酸正常值是多少 5%、83.52%、82.32%，内标平均提取回收率为99.69%，表明在本方

法的定量范围内西地那非和N-去甲基西地那非具有足够、相对均一的提取回收率

且内标具有较高的回收率。

提取后溶血、高脂样品的准确度的真实值在 15%之内，精密度 %CV ≤15%，

且至少 50% 的溶血质控样品测定值与理论值的偏差（%RE）不超过15.0%，均

满足相应的接受标准，表明人血浆溶血现象对西地那非血浆样品真实浓度测定无

影响。

西地那非的溶液与血浆在相关条件下均保持稳定。

1. 小结

本研究对测定人血浆中西地那非的 LC‑MS/MS 法进行了全面方法验证。经验

证的西地那非的定量范围为 4.00 ng/mL ~ 1000 ng/mL。方法验证结果证明了本

方法对于测定人血浆中西地那非浓度的可靠性。此方法的选择性、准确度、精密

度、基质效应、制备后样品稳定性、定量下限、稀释可靠性、生物基质和储备液

在储存和处理过程中的稳定性、溶血和高脂稳定性以及全血稳定性等均满足接受

标准。

参考文献

[1] 万艾可说明书

[2] 2020版中国药典四部 9012，生物样品定量分析方法验证指导原则