蛋白质免疫印记技术实验报告

实验二 蛋白质免疫印迹技术

河北大学生命科学学院2010生物技术 河北 保定 071002

摘要：目的：学习掌握动物抗血清的制备原理及技术，通过实际操作学会动物抗血清的制备，

掌握Western－blotting的基本原理，熟悉Western－blotting的实验操作 。方法：，使用鸡卵

类粘蛋白对小白鼠进行常规免疫，获得抗血清 ，然后利用Western－blotting 检测抗血清 。

结果：纯化的鸡卵类粘蛋白能引起小鼠的免疫反应.

关键词：常规免疫 抗血清 免疫印记

Abstract：objective：learn to master the theory and technology of preparing animals’

antirumby operating the experiment in person ,learn to prepare the animals’ antirum ,

mastering the basic principles of Western－blotting, and being familiar with the

experiment operation of Western－blotting. Methods : using chicken ovomucoid operating the

routine immunization of , and obtain the antirum, then detecting the antirum

through Western－blotting.

Result:Purified chicken ovomucoid can lead to the laboratory rat's immunoreaction

Keywords: routine immunization

antirum

Western－blotting

前言

免疫印迹(Western blotting)是一种检测固定在固相基质上的蛋白质的免疫化学方法该法是在

凝胶电泳和固相免疫测定技术基廉洁自律证明模板 础上发展起来的一种常规技术，是根据抗原抗体的特异性结

合检测复杂样品中的某种蛋白的方法。进行免疫之前必须具备可特异性识别目的蛋白质的单

抗或多抗，以及含有目的蛋白质的粗制或纯化的样品。因此，免疫印迹可以从复杂抗原中检

出特定的抗原或者从多克隆抗体中检出单克隆抗体，又可以对转移到固相膜上的抗原或抗体

进行连续分析，以取得目的蛋白的定位、定性或定量。现在，免疫印记技术，在对人的病理

研究上，也有了很大的应用，免疫印记法检测细胞中癌基因的表达及其意义。［1］（潘静坤.

免疫印记法检测宫颈液基细胞中HPV16、18 E6癌基因的表达及其意义［D］.中国医科大

学,2006.）

1、 试剂与器材

1．1小鼠的常规免疫与抗血清的制备所需试剂与器材

注射器 蜗旋混合器 纯化的鸡卵类粘蛋白 苦味酸（以75%乙醇配置）标记小鼠

佐剂（完全佐剂 不完全佐剂）酒精棉球 冰箱 离心机

1.2 Western Blot

12%分离胶，3.6%浓缩胶 马斯亮蓝 脱色液 PVDF膜 甲醇 电泳缓冲液

封闭液（0.5%BSA、TBST溶液） 一抗（自制多克隆抗血清以TBST按1:100比例稀释）

二抗（羊抗鼠，按1:1000比例 用TBST稀释） DAB显色液 蒸馏水 镊子 烧杯 海绵

垫

2 方法

2.1 小鼠的常规免疫和抗血清的制备

（1）抗原的提取与制备

1）抗原为纯化的鸡卵类粘蛋白

2）利用苦味酸（以75%乙醇配置）标记小鼠背部

（2）初级免疫：小鼠背部多点皮下注射，0.2mL/只小鼠

1）抗原与佐剂的混合：取1.5mL蛋白与1.5mL完全佐剂混合，震荡混匀，制成油包

水的形态

2）用酒精棉球消毒待注射部位

1

3）皮下多点注射，每点注射量应小于0.1mL

初级免疫后仔细观察小鼠对外源抗原的反应，两周后进行加强免疫

（3）加强免疫：小鼠背部多点皮下注射，0.15mL/只小鼠

1）抗原与佐剂的混合：取1.5mL蛋白与1.5mL不完全佐剂混合震荡混匀，制成油包

水的形态。

2）用酒精棉球消毒待注射部位

3 ）皮下多点注射，每点注射量应小于0.1mL。

（4）第二次加强免疫：加强免疫一周后进行。操作相同。

（5）收集抗血清（第二次加强免疫后一周后）

小鼠取血植树节是几月几号 。收集的血液置于室温下1h左右，凝固后，置4℃下，析出血清，离心，

3000rpm,10min。吸出血清，分装（0.05～0.2mL），贮于-20℃以下冰箱保存。

2.2 Western blotting检测抗血清

1.抗原SDS-PAGE

凝胶的制备：12%分离胶，3.6%浓缩胶

抗原样品的制备：蛋白样品与样品液混合等体积混合后在全民k歌 沸水浴5分钟。

点样：

2

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

30 30五年职业规划 30 25 20 30 30 30 25 20

1—3 粗品 4—5 抗原（纯品）

电泳：浓缩胶（120V）分离胶，170V

2.抗原样品经SDS-PAGE电泳后，取出凝胶，去掉浓缩胶和溴酚兰。从5、6号点样孔处将

胶切开，并全切下胶的右下角作为标记，有1-5号孔的胶浸在转移电泳液中用于转移电泳；

6-10号孔的胶放到考马斯亮蓝中染色15分钟，加脱色液脱色。

3.转移电泳

（1）戴上手套，剪一块与胶同样大小（？cm？cm）的PVDF膜，甲醇活化15秒，然后

浸泡在转移电泳缓冲液中15～30min待用。

（2）将海绵垫浸泡在转移电泳缓豆沙面包圈 冲液中，避免产生气泡。

（3）打开转移电泳槽的塑料夹板，负极板在下，首先放上两层海绵泡沫板，再铺上用电泳

液浸泡过的3～6层滤纸，依次加上凝胶、膜、3～6层滤纸、两层海绵泡沫板、正极板，各

层接触后均用玻璃棒赶出之间的气泡。

（4）插入电泳槽内（注意凝胶一边在负极端），加转移电泳液，4℃冰箱中稳流15mA 进行

转移电泳1h。

（5）取出膜，用冷风吹至半干，放入冰箱保存。

4.封闭

将膜放入封闭液（0.5%BSA、TBST溶液）中，37℃脱色摇床振荡反应1h。TBST振荡洗膜

三次，每次用TBST 50mL，每次5min。

5.与一抗、二抗结合

（1）一抗，3毫升：自制多克隆抗血清以TBST按1:100比例稀释，即取30微美食海鲜 升一抗，再

加入3mLTBST。

（2）将膜转移至一抗（稀释好的自制抗血清）中，37℃振荡反应1h或室温反应2h以上。

（3）于TBST中洗膜三次，每次5min。

(4)加入二抗（羊抗鼠，按1:1000比例 用TBST稀释），37℃反应1h或室温反应2h以上。

(5)TBST洗膜三次，每次5min。

6.显色

(1)取10-15mL DAB显色液置于平皿中。

(2)将膜放入显色液中，脱色摇床上震荡直至出现条带，用大量清水冲洗以终止反应。

(3)冷风吹干，扫描杂交结果。

3 结果

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