5细胞冻存方法

1. 液氮法

目前，细胞冻存最常用的技术是液氮冷冻保存法，主要采用加适量保护剂的缓慢冷冻法冻存

细胞。细胞冷冻技术的关键是尽可能地减少细胞内水分，减少细胞内冰晶的形成。采用甘油

或二甲基亚砜作保护剂，这两种物质分子量小，溶解度大，易穿透细胞，可以使冰点下降，

提高细胞膜对水的通透性，且对细胞无明显毒性。慢速冷冻方法又可使细胞内的水分渗出细

胞外，减少胞内形成冰结晶的机会，从而减少冰晶对细胞的损伤。

常用的细胞冷冻贮存器为液氮贮存器。

细胞冻存时常备的材料有：0.25%胰蛋白酶，含10%～20%的血清培养液，DMSO(分析纯)

或无色新鲜甘油(121C蒸气高压消毒)，2mL安瓿（或专用细胞冻存管）、吸管、离心管、

喷灯、纱布袋（或冻存管架）等。

主要操作步骤为：

（1）选择处于对数生长期的细胞，在冻存前一天最好换液。将多个培养瓶中的细胞培养液

去掉，用0.25% 胰蛋白酶消化。适时去掉胰蛋白酶，加入少量新培养液。用吸管吸取培养

液反复吹打瓶壁上的细胞，使其成为均匀分散的细胞悬液。悬浮生产细胞则不要消化处理。

然后将细胞收集于离心管中离心(1000r/min，10分钟)。

（2）去上清液，加入含20%小牛血清的完全培养基，于4℃预冷15分钟后，逐滴加入已无

菌的DMSO或甘油，用吸管轻轻吹打使细胞均匀，细胞浓度为3106～1107/mL之间。

（3）将上述细胞分装于安瓿或专用冷冻塑料管中，安瓿装1～1.5mL在火焰喷灯上封口，

封口处要完全封闭，圆滑无勾。冷冻管要将盖子盖紧，并标记好细胞名称和冻存日期，同时

作好登记（日期、细胞种类及代次、冻存支数）。

（4）将装好细胞的安瓿或冻存管装入沙布袋内；置于液氮流行英文歌曲 容器颈口处存放过夜，次日转入

液氮中。采用控制降温速度的方法也可采用下列步骤：先将安瓿置入4℃冰箱中2～3小时，

再移至冰箱冷冻室内3～4小时（此步可省略），再吊入液氮容器颈气态部分存放2小时，最

后沉入液氮中。

2. 分布降温法（深低温冰箱法）

细胞系冻存程序：

1) 单层细胞的消化。将经24~48小时培养关于海的古诗 已长成单层的传代细胞培养物弃去生长液，加适

量ATV，1~2分钟后倒弃ATV，再加入少量ATV液，经0.5～1分钟倒去ATV，室温或37oC

温箱作用2~3分钟，视细胞解离情况，拍打细胞培养瓶。使单层细胞完全解离。SP2／0瘤

细胞，待生长好后用吸管吹打，再经1 000转／ 分离心lO分钟。

2) 离心洗涤：向培养瓶内加5~1 0m1预冷的MEM使细胞悬浮，再将其吸出置灭菌离心管

中，以1 000rpm 离心8～10分钟后弃去上清液。

3) 细胞悬液的制备：向离心管内逐滴缓慢加入预冷的冻存保护液，使细胞浓车兵 度为150~400

万／ml，然后迅速分装于安瓿瓶中，每瓶加量为lml。

4震撼的英文 ) 致冷冻结：将安瓿瓶放入带有棉垫的纸盒或塑料盒内，直立置不同条件下致冷冻结果保

存：

a、4oC两小时后移至一2OoC作用2小时，再移入一4OoC4小时后在一7OoC下24小时投

入液氮。

b， 一20oC4小时后移致一4OoC。C经4小时移人一7OoC冰箱24小时，投入液氮。

c， 一4OoC4小时后移入一70oC24小时后投入液氮。

d、一20oC4小时后移入一70oC经24小时后投入液氮中。

e、一70oC24小时后投入液氮中。

5) 液氮中保存：将冻结后的安瓿装入预冷的小布袋中，投入液氮。为防止安瓿漂浮，可预

先在小布袋中加入几块小卵石。

3. 玻璃化法

玻璃化保存(Vitrification)是一种超速冷冻方法。它是以极快的速度冷冻细胞，使细胞内外的

游离水迅速形成玻璃样物质，而不形成冰晶。这种保存方法既避免了由于慢速降温时导致的

盐浓度升高，又防止了由于冰晶形成造成的物理损伤，可获得较高存活率。

玻璃星座的性格 化首先由Luyet在1937年提出，他认为生命是生物活体系统的原子或其他结构元的一

种特殊排列．并且轻微的排列位置扰动就会破坏平衡从而导致死亡，而结冰时的驱动力会破

坏这种特殊的排列，这就是冰冻死亡的原因。玻璃

化比冻结固化方法引起的结构变化要小，因而是一种较理想的低温保存途径。

1981年，Fahy首先明确提出，用高浓度的低温保护剂溶液，可在较慢地冷却速率以及高压

条件下实现完全的玻璃化，以后又发展了一些所谓“玻璃化溶液”，使细胞、组织乃至器官

等范围广泛的生物系统玻璃化低温保存成为可能。

1985年，Rail和Fahy[ 目用这种玻璃化溶液使鼠胚胎玻璃化保存获得成功，是这种技术走

向实用化的首次突破。