基因测序的前世今生(一代测序,二代测序,三代测序最详原理)

测序技术的前世今生

测序技术的发展历程

第一代测序技术（Sanger测序）

第一代DNA测序技术用的是1975年由桑格（Sanger）和考尔森（Coulson）开创的链终止法

或者是1976-1977年由马克西姆（Maxam）和吉尔伯特（Gilbert）发明的化学法（链降解）,在

2001年，完成的首个人类基因组图谱就是以改进了的Sanger法为其测序基础。

原理：ddNTP的3’无羟基，其在DNA的合成过程中不能形成磷酸二酯键，因此可以用来中

断DNA合成反应，在4个DNA合成反应体系中分别加入一定比例带有放射性同位素标记的ddNTP

（分为：ddATP,ddCTP,ddGTP和ddTTP），通过凝胶电泳和放射自显影后可以根据电泳带的位置

确定待测分子的DNA序列。

第二代测序技术(NGS)

第一代测序技术的主要特点是测序读长可达1000bp，准确性高达99.999%，但其测序成本

高，通量低等方面的缺点，严重影响了其真正大规模的应用。经过不断的技术开发和改进，以

Roche公司的454技术、illumina公司的Solexa、Hiq技术和ABI公司的Solid技术为标记的第二

代测序技术诞生了。其大大降低了测序成本的同时，还大幅提高了测序速度，并且保持了高准确

性，以前完成一个人类基因组的测序需要3年时间，而使用二代测序技术则仅仅需要1周，但在

序列读长方面比起第一代测序技术则要短很多，大多只有100bp-150bp。

1. illumina

Illumina公司的Solexa和Hiq是目前全球使用量最大的第二代测序机器，占全球75%以上，

以HiSeq系列为主，技术核心原理都是边合成边测序的方法，测序过程主要分为以下4步：

1）构建DNA测序文库

DNA分子用超声波打断成200bp-500bp长的序列片段，并在两端添加上不同的接头。

2）测序流动槽（flowcell）

结构：Flowcell是测序的载体，课吸附DNA文库，每个flowcell有8条lane，每个lane有2

行column，每行column有60个tail，每个tail经CCD镜头课捕获荧光信号。

3）成簇（cluster）

NGS 的核心技术特点，目的在于实现将单一碱基的信号强度进行放大，以达到CCD镜头摄

取荧光的信号要求。大体原理网上都可查到，在此解答2大难理解之处：

一．可逆终止荧光dNTP(Illumina测序核心技术)

荧光修饰dNTP可逆合成终止（包括用叠氮基团即起到了可逆终止作用和用不同荧光集团区

别碱基信号的功能），是Illumina测序的最核心技术。

1. 上图是修饰过的dCTP分子结构式，在核苷酸糖基的3'位连一个叠氮基团（红色基团）。这个

叠氮基团在链延伸的时侯起到了阻止聚合的作用（理解见下图DNA复制时的5’和3’的示意图，

下一个碱基合上时是：下一个核苷酸的5’P连接到上一个核苷酸的3’OH，故如果下一个核苷酸的

3’带有叠氮基团而非自然状态下的OH时，下一个核苷酸就无法合上。）

。

2. 叠氮基团有一个特性，就是遇到巯基试剂（例如：二巯基丙醇），叠氮基团会发生断裂，

并在原来的位置留下一个羟基因此在荧光照相之后可以借此回复3’的-OH状态，百家姓故事 以供下一个碱基

合上。

3. 在碱基上，通过连接臂（蓝色基团）连接一个荧光基团。4种dNTP分别连4种不同颜色

的荧光基团。测序时，通过识别荧光基团的颜色，就可以判断原来的碱基是哪一种。

在dNTP

被添加到合成链上后，所有未使用的游离dNTP和DNA聚合酶会被洗脱掉。接着，再加入

激发荧光所需的缓冲液，用激光激发荧光信号，并有光学设备完成荧光信号的记录，最后利

用计算机分析将光学信号转化为测序碱基。荧光信号记录完成后，再加入化学试剂[

TCEP(Tris

(2-carboxyethyl) phosphine,三(2-羧乙基)膦)巯基试剂3'位阻断的叠氮基

]淬灭荧光信号,并用去除

团

，以便能进行下一轮的测序反应。

注：每一步试剂具有极高的处粉肠的做法大全 理效率，因为在要重复几百次的反应中（），每

30~40x测序

步的得率差一点，最终的结果就会差许多，所谓的指数放大效应。

缺点

1） Prephasing：在边合成边测序过程中，每个循环应该合成一个碱基，因为某些原因，

会一个循环合成二个或更多的碱基，这种多合成碱基的情况就称为Prephasing。叠氮基团在

常温下不是很稳定，尤其是3'位的叠氮基脱落，是导致测序时的Prepha的主要原因。

Prephasing越严重，则测长越短（因为多个1个循环只记录1个碱基，如果1个循环中同时

合上了多个碱基，则势必相对长度缩短）。Prephasing占了Illumina测序长度中几乎一半的

限制性因素。

（叠氮基团在常温下不是很稳定，Illumina的测序SBS试剂鼻塞偏方 都要低温保存。Illumina的新型测序仪

（HiSeq/NextSeq/MiSeq等）的内部还内置了一个小冰箱，来给试剂降温。）

2） Phasing：在边合成边测序过程中，每个循环应该合成一个碱基，因为某些原因，

会一个循环没有合成碱基，这种少合成碱基的情况就称为Phasing。用修饰的dNTP代替天

然dNTP来进行边合成边军队文职干部 测序的工作，就会遇到天然聚合酶对修饰dNTP的聚合效率低的问

题。Phasing越严重，则测长越短。Phasing是除Prephasing外的另一个重要长限制因素。（另

外还有的两个测长限制因素是：桥式PCR对文库长度的限制、和激光会打断DNA链。

（天然聚合酶对修饰dNTP的聚合效率低：Illumina用基因工程定向进化的方法不断地

改进其测序聚合酶，以提高酶对修饰dNTP的合成效率。现在Illumina的试剂已经改到

V4版。Illumina的每次酶改版，都带来测序能力的大幅提升。）

二 化学方法选择性、定点切断特定DNA链

在Illumina的测序过程中，无论是单端还是双端测序，都会用到特异选择性链切断的过程。

其中单端测序的要切断1次，双端测序中的两条链要先后各切断1次（共2次）。

单端测序（35cycles）：在完成桥式PCR后，把Read 1测序引物杂交到模板上之前，需要切

断桥式PCR所形成的双链中的一条，只留下单一的模板链，以作为模板，供下面的边合成、边

测序之用。

方法：高碘酸希夫反应：过碘酸把糖类相邻两个碳上的羟基氧化成醛基。

原理：P5最后一个碱基A的糖基的第4和第5位的C分别加入一个-OH（二羟基-diol，即构

成P5-diol-OH），桥式PCR后用高碘酸钠溶液处理，高碘酸根快速、精确地将二个醇基之间的那

个碳碳键切断，洗掉P5相接的那条DNA链，当然，最后一个碱基A也被洗掉了，如下图：

双端测序

第一条链切断（在上图中的第2步）：第一次桥式PCR之后（25-28cycles）和单端测序中的那次

切断的目标一样，是要留下双链中的一条，以作为read 1的测序模板。

方法： 通过在P5中加入一个U碱基（具体序列信息待查），而后在要切断这链链的时侯，

用USER酶（Uracil Specific Excision Reagent，尿嘧啶链特定切断试剂）来切一下。

USER™（尿嘧啶-特异性切除试剂）酶在尿嘧啶位置产生一个单核苷酸缺口。USER 酶是尿嘧啶 DNA 糖基化酶（UDG）和 DNA 糖

基化酶-裂解酶 Endo VIII 的混合物。UDG 催化尿嘧啶碱基的切割，形成一个脱碱基（脱嘧啶）位点，但保持磷酸二酯骨架结构完整。

Endo VIII 的裂解酶活力使脱碱基位点 3 和 5 端的磷酸二酯键断裂，释放无碱基的脱氧核糖。

第二次切断（上图中的7）：

方法： “甲酰毛笔草书字帖欣赏 胺基嘧啶糖苷酶，FPG”对“8-氧鸟嘌吟糖苷，8-oxo-G”的选择性切断作用。

P7的3’末端最后一个G被修饰为8-oxoguanine，是FPG的作用位点，Fpg就把“8-oxo-G”碱

基切掉（步骤A），并把那条链给切断（步骤B），剩下的结构是P7的3’末端有一个与上一个

核苷酸的3’-OH相连的磷酸基以及一个不完整糖基的磷酸基，也就是上图中，其5’

磷酸基团连接着上一个核苷酸的3’端，所以此结构相当于Blocked P7 接头的3’ ，起到了阻止链

延伸的作用。

在后面重新长簇的时候，会重新利用这个接头，所以要恢复3'端羟基，此时再用“脱嘌呤嘧

啶内切核酸酶，AP-endonuclea”把带不完整糖基的那个磷酸基切掉（至此，彻底切掉了P7的最

后一个尿嘧啶G），3'端羟基就露出来了（步骤C）。

4）测序

边合成边测序，向反应体系中同时添加DNA聚合酶、接头引物和带有碱基特异荧光标记的

4中dNTP（具体见上文）。这些dNTP的3’-OH被叠氮基团保护，因而每次只能添加一个dNTP，

这就确保了在测序过程中，一次只会被添加一个碱基。同时在dNTP被添加到合成链上后，所有

未使用的游离dNTP和DNA聚合酶会被洗脱掉。接着，再加入激发荧光所需的缓冲液，用激光激

发荧光信号，并有光学设备完成荧光信号的记录，最后利用计算机分析将光学信号转化为测序碱

基。这样荧光信号记录完成后，再加入化学试剂淬灭荧光信号并去除dNTP 3’-OH保护基团，以

便能进行下一轮的测序反应。

30x-50x测序深度对于Hisq系列需要100小时，而对于2017年初最新推出的NovaSeq系列

则只需要40个小时！

下面是测序量比较（双流动槽为例，如为单流动槽则测序量减少为下表的一半，时间不变）

一次测序的数据总产量的单位Gb，不是计算机字节，而是测序碱基的数目（Giga ba）

第三代测序技术

单分子测序，以PacBio公司的SMRT和Oxford Nanopore Technologies纳米孔单分子测序技

术为主，最大的特点就是单分子测序，测序过程无需进行PCR扩增，超长读长，平均达到10Kb-15Kb，

是二代测序技术的100倍以上。

基本原理是：边合成边测序的原则，DNA聚合酶和模板结合， 4 种碱基（荧光标记dNTP）,

在碱基配对阶段发出不同光,根据光的波长与峰值可判断进入的碱基类型。读长主要跟酶的活性

保持有关。

SMRT技术的测序速度很快，每秒约10个dNTP。但是，同时其测序错误率比较高（这几乎

是目前单分子测序技术的通病），达到10%-15%，而且以缺失序列和错位居多。但可通过多次测

序来进行有效的纠错。

PacBio SMRT技术除了能够检测普通的碱基之外，还可以通过检测相邻两个碱基之间的测序

时间，来检测碱基的表观修饰情况，如甲基化。因为假设某个碱基存在表观修饰，则通过聚合酶

时的速度会减慢，那么相邻两峰之间的距离会增大，我们可以通过这个时间上的差异来检测表观

甲基化修饰等信息。

Oxford Nanopore

Oxford Nanopore 的MinION是另一个比较受关注的第三代测序仪，俗称U盘测序仪。是基

于电信号而不是股权变更协议 光信号的测序技术！

技术关键是特殊的纳米孔，孔内共价结合有分子接头。当DNA碱基通过纳米孔时，它们使

电荷发生变化，从而短暂地影响流过纳米孔的电流强度（每种碱基所影响的电流变化幅度是不同

的），灵敏的电子设备检测到这些变化从而鉴定所通过的碱基，理论上，它也能直接测序RNA。。

附：