2023年4月18日发(作者：fcfs)花鲈肌肉和肝脏组织细胞原代培养
1. 细胞培养准备工作
准备工作的内容包括器皿的清洗、干燥与消毒,培养基与其他试剂的配制、分装
及灭菌,无菌室或超净台的清洁与消毒,培养箱及其他仪器的检查与调试;具体工作如
下：
一、 清洗
（1） 常用器具：细胞培养瓶、细胞培养板、培养皿、广口瓶、烧杯、量筒、玻
璃棒、电子天平、纱布、脱脂棉、止血钳、镊子、解剖剪、解剖刀、解剖
针、注射器、注射器过滤器、移液枪、枪头、离心管、细胞冻存管、酒精
灯、试管架、超净工作台、倒置显微镜、生化培养箱、烘箱、液氮罐、封
口膜、喷壶、以及洗刷用品等;
（2） 玻璃器皿清洗：烧杯、量筒、玻璃棒、广口瓶瓶盖不泡盐酸,清洗赶紧后
直接高压灭菌等玻璃器皿自来水刷洗,除去灰尘,烤箱中烘干,然后再浸入
5％稀盐酸中12小时以除去脏物、铅、砷等物;泡盐酸12小时后立即用自
来水冲洗,再用洗涤剂刷洗,自来水冲干净,然后用蒸馏水冲洗干净后用烤
箱烘干,高压灭菌,烘干备用;
（3） 塑料器皿的清洗：细鲜虾鸡蛋饼
胞培养皿、培养板、培养瓶可以直接使用,进口枪头、
进口离心管高压灭菌;
（4） 金属制品的清洗：止血钳、镊子、解剖剪、解剖刀等先用洗涤剂刷洗,后
用自来水冲干净,然后用75％酒精擦拭,再用自来水,然后用蒸馏水冲洗,
再烘干或空气中晾干;放入铝制盒内包装好,高压灭菌,再烘干备用;
（5） 棉织品：纱布和脱脂棉,高压灭菌,再烘干备用;
二、 溶液配制
（1） PBS：
配方一----用电子天平准确称取NaCl / g,KCl / g,KH2P04/ g,Na2HP04-
12H0/ g溶于800 mL的超纯水中,用玻璃棒搅拌至溶解后调节pH值为～,
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然后定容至1L;置于高压灭菌锅中灭菌30min,冷却到室温后分装,于4℃
冰箱冷藏备用;
配方二----等渗1X PBS细胞培养用,用电子天平准确称取NaCl/浓度为
8/=,本配方主要靠NaCl,KCl/浓度为=,NaHPO12HO/浓度为
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358= ,NaHPO2HO/浓度为358= ,KHPO/浓度为136= ,溶于800 mL的
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dddH2O,用玻璃棒搅拌至溶解各奔东西是什么意思
,dddH2O定容至1000ml;置于高压灭菌锅中灭
菌30min,冷却到室温后分装,于4℃冰箱冷回味近义词
藏备用;
配方三----用电子天平准确称取NaCl / g,KCl / g,KHP04/ ,NaHPO-
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7H0/ g,MgCL6HO/,CaCL/溶于800 mL的超纯水中,用玻璃棒搅拌至溶
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解后调节pH值为～,然后定容至1L;置于高压灭菌锅中灭菌30min,冷却到
室温后分装,于4℃冰箱冷藏备用;
（2） %胰蛋白酶溶液：胰蛋白酶粉末1：250,用PBS在容量瓶中定容至100ml,
微孔滤膜过滤除菌,分装,于－20℃保存;
（3） ％胰蛋白酶％EDTA消化液：准确称取的Trypsin和的EDTA,用PBS在容量
瓶中定容至100ml,调节pH值为,用孔径为m的滤膜过滤除菌,用2mL的
离心管分装,冻存于-20℃冰箱备用;
（4） 培养基：基础培养基MEM,这是使用最为广泛的培养基；完全培养基配置方
法为：1L MEM基础培养基添加 HEPES充分溶解后,用NaOH将PH调到,加
2ng/ml bFGF,20%小牛血清,1mmol/L的L-谷氨酸,50mmol/L的2-巯基乙
醇,100IU/ml青霉素和100ug/ml链霉素;
（5） HEPES溶液：配置100贮存液1mol/L,在99ml培养液中加入1ml贮存液,
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度任为10mmol/L;100贮存液1mol/L配置方法：取溶于90ml双
蒸水中,用1mol/L NaOH调PH至~,然后用水定容至100ml,过滤除菌,分装
2ml小瓶,4℃或-20℃保存;
三、 培养室的灭菌
（1） 室内灭菌：每周打扫一次,先用自来水拖地、擦桌子、超净工作台等,然
后用新洁尔灭擦拭;
（2） 生化培养箱灭菌：先用3‰新洁尔灭擦拭,然后用70％酒精擦拭,再用紫
外灯照射;保持培养箱内空气干净,定期消毒;定期更换蒸馏水;
（3） 实验前灭菌：打开紫外灯20-30分钟 ;
（4） 实验后灭菌：用70％酒精3‰新洁尔灭擦拭超净台、边台、倒置显微镜
的载物台,打开紫外线照射20-30min;
四、 实验人员的无菌准备：
（1） 肥皂洗手;
（2） 穿好隔离衣、带好隔离帽、口罩、穿好鞋套;
（3） 戴乳胶手套,75％酒精擦手;
五、 无菌操作
（1） 凡是带入超净工作台内的酒精、PBS、培养基、胰蛋白酶的瓶子均要用70％
酒精擦拭瓶子的外表面 ;
（2） 靠近酒精灯火焰操作;
（3） 打开和盖上盖子前后灼烧瓶颈和盖口附近;
（4） 无菌级；别高的物品不能触碰无菌级别低的物品;手不能从敞开的瓶口上
方经过;
（5） 各种操作要靠近酒精灯,动作要轻、准确,不能乱碰;如吸管不能碰到废液
缸;
（6） 吸取两种以上的使用液时要注意更换吸管,防止交叉污染;
（7） 手握试管、滴管、移液管时尽量远离工作端;
（8） 尽可能移走不需要的物品,在操作中经常用酒精擦拭台面;
（9） 尽可能减少开盖时间;
（10） 随时擦去任何溢出物;
六、 原代细胞培养
方法一：组织块培养法主要用于肌肉组织的培养
（1） 选取身体健康,无病的幼鱼,用解剖爱国论文
针进行头颅穿刺法杀鱼,70%酒精消毒
体表,然后放在无菌的培养皿中,待用;
（2）
解剖鱼体,拿入无菌操作台中,用无尘纸垫在鱼体下,用直头解剖剪剔除
皮肤,取体表肌肉组织,然后剥去内脏膜取肝脏组织并刮去多余的外膜,
放入培养皿,用PBS清洗三遍,放入70%酒精中消毒3~4mim,再用PBS清
洗3遍,除去血块,用加入双抗的无血清培养基清洗一遍;
（3） 切割组织块,用解剖刀在培养皿上切割组织,切割过程中,加入适量的培
养液保持组织湿润;
（4）桌面分区
悬浮移瓶,切割完成后用新鲜的培养基悬浮小组织块,用移液枪移入培养
瓶中,吸弃上清液,保留少量培养液,盖上瓶盖,轻轻晃动瓶子,使组织块
在瓶底均匀铺展开,用玻璃棒调整组织块使其均匀分布,组织块间隔为
宜,25cm培养瓶中加入20~30个组织块;
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（5） 细胞贴壁,将培养瓶在培养箱中平放2小时,使组织贴壁,然后侧放半个
小时,使液体浸出,然后吸出液体;
（6） 细胞培养,从培养瓶边角加入3ml培养基,盖上瓶盖 ,满满放入培养箱中
平放培养;如有悬浮,需重新贴壁;
（7） 初始培养5天后换一次培养基,后期每隔2-4天换一次培养基;换培养基
的时候,吸走一半旧的培养基,再加入一半新的培养基;
（8） 观察、记录细胞迁出情况,适时拍照;1~3天内迁出较少,尽量不要观察;
方法二：酶消化解离法除肌肉和结缔组织之外
（1） 选取身体健康,无病的幼鱼,用解剖针进行头颅穿刺法杀鱼,70%酒精消毒
体表,然后放在无菌的培养皿中,待用;
（2） 解剖鱼体,拿入无菌操作台中,用无尘纸垫在鱼体下,用解剖剪
打义和团运动
开腹腔注意不能碰破肠道,剥去内脏膜取肝脏组织并刮去多余的外膜,
放入培养皿,用PBS清洗三遍,放入70%酒精中消毒3~4mim,再用PBS清
洗3遍,除去血块,使肝脏呈灰白色,用加入双抗的无血清培养基清洗一
遍;
（3） 胰酶消化,将组织切割成1mm大小,用％胰蛋白酶％EDTA消化液消化
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20min后添加3ml完全培养基终止消化,收集含有组织块的细胞悬液,以
2200rpm离心2min；将所得沉淀用1ml完全培养基悬浮后接种在25cm培
养瓶中,培养温度为24℃;24h后添加1ml完全培养基至培养瓶;每隔7天
换一次培养基;
（4） 当从组织块迁移出的细胞停止生长时,用%胰酶消化混合液消化细胞后,
在原培养瓶继续培养,并在新鲜培养基中添加一半旧培养基;如此重复传
代若干次,直至细胞长满培养瓶后按照常规方法以1：2比例传代;
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