2023年4月18日发(作者：日本著名女歌手)细胞增殖、凋亡-检测方法汇总
1.
直接计数法
面单粗暴、傻瓜式的检查方法！利用计数板或计数仪得出细 该
数目•然后对数目逬行比较。
方法需要对不同时间原的细胞分别固定•而后在光疑下计数,可绘
制出细胞生长曲线。而具 不足之处在于无法区分壇蓿细胞与非增殖抵胞，下适合样品奴星參和评估特
定亚群的情况。
2H・TdR
「渗入法
OH
腺龜碇核百(是持有的滅基「也是合成的必需物氐
TdR )DNADNA
用同位素中标记
TdR
即
3
H-TdRDNADNA
作为合成的前体渗入合成代谢过程,通过液体闪烁计数器可迴走细胞的放射 性强
虐，间接放映出细胞增殖情况。
该方法优点在于敏感性高”客观性强,盍每性好.但是爲要一走设备集件，也存在放时性核素 污染问
题。
3Brdu/EdU
、检测法
Brdu&EdUDNA
均是胸腺嚅睫的衍生物均可代替胸腺嚅噪在合成期掺入细胞中。
r
不同的是检测法可利用「专
BrduBdu
性抗体和具他細胞标记物对细
'进行双重染色,可判断
増殖细胞的种类及増殖速度，不仅适用于体外实验也能用于活体实验。这个方法最大的缺点需 要变
性才能与抗体结合,破坏了双链结构导致染色弥散、准确性降低等问题。
DNADNA
r
J
EdUEdUApolloDNA
检测法则基于与荧光染料的特异性反应检测复制活性适用于细胞増殖、细
r
的研究，尤其适合进行、、小分子化合物及其他药市场总监英文
物的筛选实
siRNAmiRNA
胞标记示踪筈方
IEI
验。检测染料只有抗体大小的田胞内很容易就扩散,无需变性。
EdUBrdU1/500,DNA
rdU与EdU检测优缺点综合比较
BrdU EdU
检测分子 大 很小
检测方式
影响其他标记 是 否
DNA
变性
实验时间 过夜
检测灵敏度 一般 灵敏
免疫反应 化学反应
需要
不需要
2.5小时
4WITT&CCK8
、检测法检测法
MTT
检测法反映细胞的能臺代谢「是检测细胞増殖活力的一种简便准确方法其原理是在活纟田 胞
生长和增殖过程中,线粒体内的脱氢酶可将黄色的分解为蓝紫色的水不溶性的甲瓒
MTT
(Formazan ),DMSO
并沉积在细胞中(死细胞无此功能。溶解细胞中的紫色结品物,用酶联 检测仪在
490nni
波长处检测其光密度值，可间接反映活细胞数量。
CCK8MTTCCK-8WS8 ( MTT
是的升级版，细胞活性检测试剂中含有「的类似物)，在电子耦 合
试割存在的情况下,可被线粒体中的脱氢酶还原成橙黄色的甲瓒(用酶联检测 仪在
Formazan ),
450nm
波长处检测其光密度值.可间接反映活细胞数量。
细胞增殖越快,则颜色越深；细胞青性越大,则颜色越浅。
MTT法
CCK-8^MWST-8^
还原后的Fo rma.z art是水溶性的
还原后的F ormaz ari是水洛性的
（需要加有机溶剂溶解）
（不需要溶解）
重现性好
操作简便
测定波长：450—490nm 测定波长：490—550nm
弃上清时，会损失小部分的■
Formazan,故重复性略差
操作繁琐
v
1瓶溶液，无需预制，即开即用 需加有机溶剂溶解，工作量大
5. CFSE
检测法
CFSE
是一种可咅透细胞晅的荧光染料，可逆的与细胞内的氨基结台偶联到细胞蛋白质上■是种 良好的细胞
标记彻.当细胞分裂时，标记荧光可平均分配至两个予弋细胞中因此荧光强席呈对逐级递减,可
CFSECFSE
r
利用流式细胞仪对其进行分析。
轴昭代数惦加.荧光彌從辭
CFSE
将纸胞昙液加入筈体积的工作液
CFSE
,37C^WWmin40%
&
用体积的冷小牛血清立即终止标记
4 Amin 苹至曲巾三用违壬昙药三:◎+立M沛希目如冏日八市
6.Ki・67发人深省意思
核抗原染色法
KM57
是目前较为肯走的核増殖标志物它只参与増殖细胞核反应,其耒达壇强是细胞有丝分 増殖活 勲
（
性增强的一个可标记，硏究表明的表达能可廉而迅速的反应恶性肿就的増值 率。
K367
Ki 67
几乎在疝心從
灵的星證都有坂达，
海常彌周期的活
18
以期（
GT • 5 .（52 .
M
）可以检浏到,乔
在痒止潮（
GO ） IS
测 不現
二.细胞增殖一旦过分，就有可能形成肿瘤。为了维持机体健康，细胞走向凋亡。现将细胞凋亡检测方法介绍给大
一形态学检测
仁通过光学显微镜或倒置显微傥观窖细胞形态。
1
）玉染色细胞
阔亡细胞的体积变小、变形,细胞腫芫整但出现发泡现球，细胞凋亡晚期可见周亡小体，贴壁 细拒出现皱缩、变国、脱落。
2）
染色细胞
常用吉姆萨染色、瑞氏染色等，凋亡细胞的染色质浓缩、边缘化核膜裂解、染色质分割成块 状和
j
凋亡小体等典型的凋亡形态。
Giemsa staining
姬 姆萨
染液
形态学特征:
（天青色索、伊红、
次甲蓝的混合液）
■
dp J
〔
瑞氏
Wright' s stain
也化
（关蓝一伊红）
o
旬
0
彌亡小体
乙通过荧光显微镜和共聚焦激光扫描显微镜观家细胞形态 以细胞核染色质的形态学改变为指标来评判细胞
凋亡的进展情况。该法中常用的特异性染 料有三种染料与
DNA：Hoechst 33342, Hoechst 33258,DAP1.
DNADNAA・T
的结合是非嵌入式的,主要结合 在的碱基区。紫夕卜光激发时发射明亮的蓝色荧光。
细胞凋亡中细胞核染色质的形态学改变分为三期:期的细胞核呈波纹状或折缝样,部分染色质 岀现浓缩状
I
态；期细胞核的染色质高康凝聚、边缘化；期的细胞核裂解为碎块，产生阔亡 小体。
II 8II b
Hoechst^与DNA特界结合的活性 染料，储存液用蒸溜水配成 Img九色鹿成语
/mlffj浓度'使用时用PBS稀禅 成终浓度为黔
DAPI为半通透性,用于常规固定细 胞的诛色.储存液川蒸窗水配成 im号伽啲浓度.使用终浓度-般 为0.5 ~lmg/mL
con tro I stage I
stage Ila stage 1 ib
DAPI
染色
厝 :处任的彤 ◎化
11
HU^
BII
r Mi
3・
通过谤射电子显微镜观察细胞形态
凋亡细匏体秧变小,表面陋毛消失「细胞质浓缩。
凋亡期()的细胞核内染色匪高度盘绕‘岀现许多称为气冗现象的空泡结
Ipro-apoptosis nuclei
构；期细胞核的染色质高度澀聚、
II a
边缘化；细趙凋亡的晚期 ffl 核裂解为碎块,产生凋亡
r
小体。
control stage Ila
proapoptosis nuclei < i
m
国电眾徵憧戏索浏匚过
2fJurkadffljfeF
冲 檢圾色质的瞬态学黒空
二 Annexin V/PI 染色
周亡细胞的细胞表面的改变之一是歲脂酰鉉氨酚(PS )从细胞睡内转移到细胞胆外•便PS暴靈 在细胞脛夕卜
表面。
Annexm ▽是一种Ca+依載的磷脂结合雷白，对PS有高癢的亲和性亠P?(碩化丙噓)是一种对 DMA染色的
细胞核染色试讯］「在贡入dsDNA后釋放红色荧光。尽普PI下绽通过活细胞腫「但却 能穿过破垠的细跑膜
而对核染色，
・广“讥 朗细 死亡细
*t wirrjfi wi /
三的片段化
DNA
凋亡细胞DNA断裂点均有规律的茨生在F刻傑之闾,出现18MOObpDNA片段而坏死细胞的
，
DNA断裂点为无特征的杂乱片段,利用此特征可以确走群体细胞的死亡，井可与坏死细膽区 别。
•MAbddkr
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ldn & CMIW-OA)
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^s 3^
四检测法
Tunel
细胞;周亡中,染色体DNA双链或单链断裂而产生大臺的粘性3 -0H末端，可在脱雪核糖核昔酸末
鑰转移酶（TdT ）的作用下，将脱氧核糖核巷酸和荧光素、过氧化物詰、减性漆酸蒲或生物素形 成
的衍生物标记到33H末端,从而可逬行凋亡细胞的检测。
NOAMAL
APO*TO$t$
DNA
LEGfNO
o
TdT Mo^x>fAledNkkMtde
Bc*fcn
• SUMaMdhA
(
五线粒体膜电位
红粒体在细胞凋亡中起着枢纽作用，线粒体跨腹电位的下降，被认为是细胞凋亡级联反应过程 丰最
早发生的事件，一旦线粒休崩溃.则细胞周亡不可逆转。
因而，线粒体跨鹿电位旳存在，使一些亲脂性阳离子荧光染料如、等
Rhodanne123JC-1. TMRM
可接合到线粒体基质，其荧光的塔强或减弱说明线粒体内膜电负性的增高或降低。
方法：将正常培养时细挪诱导;周亡细胞加入终诙店为、
DRhodamine123 ( 1mM )JC-
1 ( 1mM ) . TMRM ( 10DnM ) , 37C30min ,
平衡流式细胞检测细胞的荧光理度。
原理：染料在正常细胞内聚集在线 粒体内■形成多聚
JC-1
休，发红色荧光；而在 凋亡细胞内.由于线粒体膜电位的破
坏， 不能聚集到线粒体内•以单体的形式存在 于胞质内发绿
色荧光。
Flow cytometric analysis of Jurkat cells using the MitoProbe™ JC-
1 Assay Kit. Jurkat cells were stained with 2 pM JC-1 for 15 mm at
37 C, 5% CO2, and then washed with phosphate-buffered saline
(PBS) and analyzed on a flow cytometer using 488 nm excitation
with 530 nm and 585 nm bandpass emission filtors. (A) Untrooted
cultured colls. (B) Cells induced to apoptosis with 10 pM
camotothecin for 4 hr at 37 C・
六细胞色素穆放
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七Caspa活性检测
Caspa
家族在周亡信号转导対许多途径中发挥功能。
Caspa-3IE^32kD )Caspa-3
以醍原(的形式存在于担浆中，在澹亡早期阶段祓激活，活化的 由两
个大亚墓和两个小亚基(组成，裂解相应的胞浆胞核底物，最 终导致细胞凋亡，但在细胞
(17kD)12kD )
凋亡的晚起水泡了怎么办
期和死亡细胞，的活性明显下降。
caspa-3
Entmc^lular
Caspaso 6
Caspa 9
*CrmA
Nucl9U9
J
凋亡相关蛋白检测
-促凋亡分子
Bax, Bel-Xs, Bak, Bad, Bid, AIF,Apaf・l
等
・抑制凋亡分子
Bcl・2. BcMLbcr/abl kina
和
•相关信号通路分子检测 抗凋亡信号通路
PI5K-Akt pathway
NIK-NF-B
K
pathway
促凋亡信号通路
MKK-JNK pathway
Fas-FADD pathway
P53 pathway
综上，细胞凋亡分析总体标准：
凋亡是多原因、多通路参与过程，不能依据单一指标来判定细 胞
凋亡；需多指标同时检测。
凋亡细胞不一样时间出现凋亡事件不一样，而每个指征维持一 段
时间，则需要在不一样时间点进行釆样，以确保检测结果正确性。
试验需设定阳性&阴性对照，避免出现假阳性或假阴性。
