2023年4月17日发(作者：蒜苗的生长过程)SYZY075-2013 非禽源细胞及其制品外源病毒检验操作规程
1 目的
该SOP用于规范非禽源细胞、毒种及其制品的外源病毒检验。
2 适用范围
该SOP适用于非禽源细胞、毒种及其制品的外源病毒检验。
3 职责
进行该项检验的检验员应当按该SOP进行检验，检测室负责人负责监督该操作规程的
正确执行。
4 检验
4.1 实验材料/仪器设备
4.1.1 待检样品（2～3瓶/批，另有规定除外）、0.25%EDTA胰蛋白酶溶液、DMEM或
MEM培养液、PBS （pH7.2）、胎牛血清（或新生牛血清）、双抗（首先配制成青霉素100000U/ml、
链霉素100000g/ml浓度贮存液，－20℃保存，使用时终浓度分别为100 U/ml、100g/ml）、
0.2%豚鼠红细胞、0.2%鸡红细胞、特异性阳性血清、吉姆萨染色剂或其它适宜染色剂、阳
性对照用毒种（根据需要选用）、牛病毒性腹泻病毒/粘膜病病毒（BVDV，Oregon C24V株、
NADL株或其它毒株）、猪细小病毒（PPV，NADL-2株、79荨麻疹的症状
09株或其它毒株）、猪瘟病毒（CSFV，
Thiverval株或其它毒株）、蓝舌病病毒（BTV，暂无）、狂犬病毒（RV，CVS-11株）、犬细
小病毒（CPV，CPV-DD株）、马传染性贫血病毒。
4.1.2 恒温培养箱、CO培养箱、－70℃低温冰箱及普通冰箱、低速离心机、普通显
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微镜荧光显微镜、水浴锅、25cm细胞培养瓶、吸管（1ml，5ml，10ml）、多孔细胞培养板。
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4.2 检验步骤
4.2.1 样品处理 取样品。对毒种或活疫苗进行检验时，将样品混合，其中疫苗制品
1ml稀释液中应至少含10头份（另有规定除外），8000g离心10min后取上清备用；对细胞
（培养面积需大于75cm）进行检验时，经3次冻融后混合作为检品。毒种和活疫苗样品的
2
具体处理如下：
4.2.1.1 如毒种或疫苗病毒不感染所选用的细胞或对所选用的细胞不产生细胞病变和
不引起红细胞吸附时，不进行血清中和。
4.2.1.2 需要中和的样品，选择单特异性血清进行中和，如对检品中病毒中和不完全时，
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可用效价更高的血清重做，或根据病毒特性，适当对毒种或疫苗进行稀释，但接种量最低不
得低于1头份；或用制品使用对象进行检验。不同疫苗处理方法见表1。
表1 不同样品处理方法
被检样品
猪瘟活疫苗及其毒种 不中和 不中和
猪繁殖与呼吸综合征活疫苗及其毒种 中和 中和
高致病性猪繁殖与呼吸综合征活疫苗及其毒
种
猪乙型脑炎活疫苗及其毒种 中和 中和
猪伪狂犬病活疫苗及其毒种 中和 中和
狂犬病活疫苗（Flury株）及其毒种 不中和 中和
犬瘟热、腺病毒病、细小病毒病、副流感病
毒2型呼吸道感染四联活疫苗及其毒种
犬瘟热、细小病毒病二联活疫苗及其毒种 中和 中和
山羊痘活疫苗及其毒种 中和 中和
水貂犬瘟热活疫苗及其毒种 中和 中和
狐狸脑炎活疫苗（CAV-2C株）及其毒种 中和 中和
小反刍兽疫活疫苗及其毒种 中和 中和
犬细小病毒活疫苗及其毒种 中和 中和
荧光抗体 致细胞病变检查法
检测法 和红细胞吸附性外源多吃什么养肝
病毒检验
不中和 中和
中和 中和
4.2.2 细胞的选择 细胞选择原则：每一种被检样品应接种以下细胞：（1）绿猴肾（Vero）
传代细胞；（2）疫苗靶动物的胚胎细胞，或新生动物细胞，或细胞系。不同检查方法具体的
细胞选择详见表2。
表2 不同非禽源细胞及其制品外源病毒检验法选用的细胞
制苗用细胞
来源或疫苗
靶动物
荧光抗体检查法
待检外源 选用细胞
BVDV
猪 Vero、PK15或ST
PPV PK15或ST
CSFV PK15或ST
牛
羊 BVDV 牛睾丸细胞或BT或MDBK Vero、绵羊睾丸细胞或山羊肾细
BVDV 牛睾丸细胞或BT或MDBK
BTV （*2）
牛睾丸细胞或BT或MDBK
（*1）
2
致细胞病变检查法
和红细胞吸附性外源病毒检验
Vero、牛睾丸细胞或BT或
MDBK
BTV （*2）
BVDV 牛睾丸细胞或BT或MDBK
犬 Vero、MDCK、CRFK或F81
RV Vero或BHK21
CPV CRFK或F81
BVDV 牛睾丸细胞或BT或MDBK
马 Vero、马源敏感细胞
马传染性贫
血病毒
胞
马源敏感细胞（*3）
注：（*1）对于猪瘟活疫苗荧光抗体检测法中对BVDV的检验应选择BT或MDBK细胞。（*2）牛、绵羊和
山羊制品如污染BTV，可引起Vero的CPE，通过致细胞病变检查法检出外源BTV。（*3）马传染性贫血病
毒暂无相关活疫苗。
4.2.3 样品的接种和培养
4.2.3.1 样品的接种 不同检验方法选择不同的细胞进行检验，详见表2。
按4.2.1方法处理好的样品接种已长成良好单层细胞的25cm细胞培养瓶或同步接种
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（如荧光抗体检查法中对猪细小病毒的检测需要同步接毒）25cm细胞培养瓶。接种剂量为
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至少1.0ml已处理的被检样品（另有规定除外）。接种后37℃吸附1h，然后弃去接种物，用
PBS或细胞营养液洗涤细胞表面2怎么给c盘扩容
次，然后加10ml含1～2％胎牛血清（或新生牛血清）细
胞培养液继续培养。另设正常细胞对照至少1瓶。
4.2.3.2 细胞培养物的继代
将上述每种细胞培养物冻融3次后，3000rpm离心10分钟，取上清液接种于新的相应
细胞单层用于继代。每次继代均设立正常细胞对照。待检样品在每种细胞上的总培养时间应
不少于14日，培养期间细胞培养物应至少继代1次。
最后一次继代的细胞单层数量和面积、培养时间应符合荧光抗体检查法、致细胞病变检
查法和红细胞吸附性外源病毒检验的要求。可供选择的培养器皿、数量及接种剂量参考表3。
表3 选择使用的接种器皿、数量及接种量
检查方法 培养面积要求 使用器皿 接种孔/瓶数 接种量
96孔细胞培养板 20孔 0.10ml/孔
荧光抗体检查法 每种方法继代后总
致细胞病变检查法 接种面积不小于24孔细胞培养板 4孔 0.50ml/孔
红细胞吸附检查法 6.0cm
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48孔细胞培养板 8孔 0.25ml/孔
6孔细胞培养板 1孔 2.00ml/孔
林氏管 4片 0.50ml/管
4.2.3.3 培养期观察 培养期内在显微镜下观察细胞病变情况。正常细胞对照未出现细
胞病变则试验成立，如被检样品细胞出现非疫苗病毒引起的细胞病变时，则判为不符合规定；
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如无细胞ems过年放假吗
病变，培养结束时，细胞单层应按下述方法继续检验。如正常细胞对照出现细胞病
变，则试验不成立，需重检。
4.3 检查方法
4.3.1 荧光抗体检查法好习惯好人生
4.3.1.1 荧光抗体及细胞的选择和准备
根据不同的制苗细胞来源或靶动物，选择不同的检验细胞（见表2）。按步骤4.2.3进行
样品的接种与培养。
最后一次继代的细胞单层培养5～7日后用于荧光抗体检查。每种细胞按照表2中列出
的待检外源选择特异的抗病毒荧光抗体进行检测。
对每一种特定外源病毒的检验至少包含三组细胞单层：（1）被检样品细胞培养物；（2）
最后一次继代时接种100～300FAID特定病毒的阳性对照；（3）正常细胞对照。
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每一组细胞单层检查面积应不小于6.0cm。以下步骤以接种48孔细胞培养板为例。
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4.3.1.2 方法
待检细胞培养板或飞片在培养箱中培养5～7日后，弃掉营养液，用PBS（pH7.2）洗涤
2～3遍，晾干后滴加－20℃预冷的80%丙酮水溶液，置2～8℃固定30分钟，弃去固定液，
自然干燥。
可根据实际情况，选择直接免疫荧光检查法或间接免疫荧光检查法。
4.3.1.2.1 直接免疫荧光检查法
（1）用PBS（pH7.2）洗涤固定好的细胞单层1次，1ml/孔，静置3分钟后弃去洗涤液。
（2）将针对待检外源病毒的FITC标记的单特异性抗体稀释到合适的工作浓度，加入
到上述细胞单层上，0.2ml/孔，37℃孵育6010分钟。
（3）弃去荧光抗体，用PBS（pH7.2）洗涤3次，1ml/孔，每次静置3分钟。
（4）最后在倒置荧光显微镜下用蓝色激发光（波长490nm）观察。
4.3.1.2.2 间接免疫荧光检查法
（1）用PBS（总做梦是什么原因
pH7.2）洗涤固定好的细胞单层1次，1ml/孔，静置3分钟后弃去洗涤液。
（2）将针对所检外源病毒的单特异性抗体稀释到工作浓度，滴加到上述固定好的细胞
单层上，0.2ml/孔，37℃孵育6010分钟。
（3）弃去抗体，用PBS（pH7.2）洗涤3次，1ml/孔，每次静置3分钟。
（4）加入相应工作浓度的FITC标记的二抗，0.2ml/孔，37℃孵育6010分钟。
（5）弃去二抗，用PBS（pH7.2）洗涤3次，1ml/孔，每次静置3分钟。
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（6）最后在倒置荧光显微镜下用蓝色激发光（波长490nm）观察。
4.3.1.3 判定
当阳性对照出现特异荧光，正常细胞无荧光时，试验成立。如果被检样品未出现特异性
荧光，则判为合格，如果被检样品出现特异性荧光，说明样品中污染了相应的外源病毒，则
判为不合格。
当阳性对照组未观察到特异性荧光，或者正常细胞出现荧光，试验不成立。待检样品的
荧光检查法检验外源病毒判为无结果，应重检。
4.3.2 致细胞病变检查法
4.3.2.1 细胞的选择和准备
根据不同的制苗细胞来源或靶动物，选择不同的检验细胞（见表2）。按步骤4.2.3进行
样品的接种与培养。
4.3.2.2 方法 最后一次继代的总接种面积不小于6.0cm，同时设立正常细胞对照。
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培养至少7日后，用吉姆萨染色液（或其它适宜染色液）对细胞单层进行常规染色，观察包
涵体、巨细胞或其它外源病毒引起的CPE。
4.3.2.3 结果判定 在普通光学显微镜下观察，正常细胞对照未出现特异性CPE时，
试验成立。如果被检样品未出现外源病毒所致的特异性CPE，则判为合格；如果出现外源
病毒所致的特异性CPE，则判为不合格；如果疑有外源病毒污染，又不能通过其他试验排
除这种可能性时，则判为不合格。
4.3.3 红细胞吸附性外源病毒检验
4.3.3.1 细胞的选择和准备 根据不同的制苗细胞来源或靶动物，选择不同的检验细胞
（见表2）。按步骤4.2.3进行样品的接种与培养。
4.3.3.2 方法 最后一次继代的总接种面积不小于6.0cm，同时设立正常细胞对照。
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培养至少7日后，弃去营养液，用PBS洗涤细胞2～3次。加入适量0.2%的豚鼠红细胞和
鸡红细胞的等量混合悬液，以覆盖整个单层表面为准。分别在2～8℃和20～25℃放置30
分钟，用PBS洗涤3次，在显微镜下观察红细胞吸附现象。
4.3.3.3 结果判定 在普通光学显微镜下观察，正常细胞对照未出现外源病毒所致的红
细胞吸附现象，试验成立。如果被检样品未出现外源病毒所致的红细胞吸附现象，则判为合
格；如出现外源病毒所致的红细胞吸附现象，判为不合格；如果疑有外源病毒中国羽毛球队
污染，又不能
通过其它试验排除这种可能时，则判为不合格。
5 注意事项
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5.1 检验所用原材料应符合有关规定。如所选用细胞应纯净无污染。
5.2 中和用抗血清应为高效价、单特异性血清。
5.3 荧光染色检查法使用直接荧光抗体检测和间接荧光抗体检测均可。检验用抗体或
标记荧光抗体应为单特异性荧光抗体，可自行制备或购买商品化产品。
6 附件
6.1 荧光抗体检查检验结果记录
待检外源病毒
样品编号
病毒阳性对照
正常细胞对照
结 论
规定
规定
试验是否成立
6.2 致细胞病变检查结果记录
观察结果 致细胞病变情况 结论
样品编号
正常细胞对照 CPE现象 CPE现象
Vero
CPE现象 CPE现象 规定
CPE现象 CPE现象 规定
试验是否成立
6.3 红细胞吸附性外源病毒检验结果记录
观察结果 红细胞吸附情况 结论
Vero
红细胞吸附现象 红细胞吸附现象 规定
红细胞吸附现象 红细胞吸附现象 规定
红细胞吸附现象 正常细胞对照 红细胞吸附现象
样品编号
试验是否成立
现实的社会
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-精神富有
