外标法

气相色谱中的内标法或外标法

谈谈内标准品(内标物质)

传统上在教科书中都会很模糊的告诉学生内标准的选择方式,例如说要选安定

性好;与分析物性质要相近;在分析的基质中不能出现等,现在我对这些个"选择方

式"没有太大的兴趣,因为这个大家都知道,那现在就从另一个角度的来看看内标准

品的选择还有哪些需要注意的.1.只选一个内标准品?

当然,如果你的分析目标物就只有一个,在正常的状况下,内标准"应该"也只

会有一个才对!但是如果你的分析是多成份的,那就必须十分小心地看待在一个分

析方法内标准品的选择,如果分析物的在层析图中是平均分布在各处,那你就必须

看看你的检测方法中是否有规定内标物与分析物之间的滞留时间差范围是多少,依

此规定来选择内标,但是如果并没有规定,最好也是选择一个以上的内标来使用,因

为即使化学性质不会差太多,但在沸点方面却会有满大的差异,内标与分析物的沸

点差异过大,在GC的注射口中就无法把因为discrimibation(分辨)所造成的误差

校正回来.

如果你的分析物是性质相差颇大的(例如说同时含有醇,酸...),那别怀疑一定

是要使用一个以上的内标准品,如果多个物种再加上多成份,那就很复杂了.最低的

限度也要依照分析物的沸点高低来使用多个不同的内标准品.在美国环保署的检验

方法USEPA8270C,是一个检测半挥发性的污染物的规范,前后列了不下一百种的分

析物,就使用了六个不同的内标准品作为校正的依据,来照顾到各个不同沸点的分析

物!!

滥用药物分析大概是最严谨的了,即使是结构性质极相近的分析物,例如

morphine和codeine,amphetamine和methamphetamine,在分析时为求准确,都是以

各自的D同位素取代的标准品作为内标.

2.基质中一定不能存在?

这个问题当然是肯定的,不然定量结果会很不稳定或者是很凄惨.但是有些时

候你根本不知道哪些东西在分析样品的基质中不会存在!这时候怎么办?找以往的

文献看看别人是用甚么,这是一个方法,但要注意的是文献不一定就是对的!使用

分析物的氢同位素(D)取代物,是最妥当的,但问题是价格昂贵,而且不是每一种分析

物的氢同位素(D)取代物都有贩售,当然,如果本钱够,你可以去订购专门替你合成氢

同位素(D)取代物.如果要自己选,那就必须了解

一如虎添翼的意思是什么 下分析物的成分了.

以前曾经替人定性和定量过一阵子海水鱼中所含不饱和脂肪酸,这鱼中不饱和

脂肪酸的碳数都是奇数(或是偶数,我已经忘了),所以内标就使用了几个偶数(或

奇数)的不饱和脂肪酸,像这种内标物绝不可能出现在分析物中,且性质十分相近,

所以定量的结果一般误差都不会太大!如果完全无法确定怎办?有时候就是赌一赌

啰.........举例来说:如果你的分析物结构中含有氯的话,就可以寻找一个化合物,

而这个化合物是把其中的氯换成氟或溴,例如你可以使用2-氟联苯或2-溴联苯来当

作分析2-氯联苯的内标准品.以环境分析为例,通常在自然界中的氟及溴化物并不

多,在EPA的方法中,就经常把结构相似的氟及溴化物添加入样品中,来做为分析含

氯化合物的QC样品.所以找氟及溴来取代氯原子的化合物来作为内标,基本上还算

是很安全的.

如果实在连上述转换一个基团的内标都找不到,那至少在选择时一定要找同一

类的,分析酸就找酸当内标,分析醇就找醇当内标,直链接构分析物就不要找一个环

状的化合物来当内标,分子量不要相差太大,这算是最基本的要求!!

3.内标和分析物的滞留时间必须接近?

这个说法原则上没错,因为如果滞留时间接近,它们的物理或者是化学的性质在

某种程度上是接近的,所以有些分析方法会有这样的规定.但在某些特殊的状况下

却出了问题,事实上还真的碰过,结果在更换到第三个内标准品后,它的RT远离

分析物,反而解决了定量误差的问题!!这个案例以后有空在来聊聊.

4.内标的浓度应该是多少?

除了某些分析方法会规定必须加入多少浓度的内标外,其它的就只能靠分析员

自己来决定了.

以我为例,通常会先决定一个分析方法的检量线范围,然后开始配制不同浓度

的内标准品来注射入仪器中,分析完后选出一个大概是检量线最高浓度的波峰高度

三分之二左右的浓度,作为该前方施工 项分析的内标浓度.这样的选择方式,可以兼顾到高低

浓度的需要,一般来说,内标浓度过高除了会增加成本之外,对于低浓度的校正是会

产某些程度的误差.在某些分析方法中会强制你使用内标法而不是外标法或线性回

归的方式来定量,但是如果你的基质很复杂,一针打进仪器中,结果大大小小的出来

一堆波峰,这个时候如果你又不是使用

质谱作为侦测器的话,就必须考虑加大内标准品的使用浓度,来降低内标准品

的可能发生的积分误差!!

5.内标准怎么配制?

一旦决定了添加内标准品的浓度,就可以开始配制分析时所用的内标准品标准

溶液,相对于测试时的小量,分析员必须先估计你在这一批的分析样品有多少,然

后计算整个分析需要添加入多少的量,例如说妳需要大概100mL的内标准品标准溶

液,这时就必须再加多30%以上,一次就配好整个分析要用的量!分装或者是整瓶放

到-20度的冰箱中存放,免得做到一半发觉内标准品标准溶液用完了,再重新配制一

次,如果你是分析的新手,搞不好前后两次配得不一样浓度,那就会很凄惨了…..有

些领域的分析,很重视这种内标波峰的积分值是否是有一定的再现性!!

转自中国色谱网，作者:cation

内标与外标法的详细计算及操作方式,在这里就不再叙述,不懂得网友就请自行

去找找相关的文章.

一个分析要选择内标或外标的方式来进行定量,大概可以依照下述几个方面

来讨论!

1.适合的内标准品?

以前当学生时,老师给大家记忆很深的一句话:”采样员随便采,那你就随便分

析!”,反正采得的样品也不具代表性,随便分析也没关系!!换到这里,大概可以

改成”如果分析方法的内标准品用得不适当,那你就随便分析!”,反正做了也不

知道正不正确!这种情形对于GC分析的特性而言,是很可能发生的事.对于一位

以GC或GC/MS为定量仪器的分析员而言,必须有下面的认识:

a.不适当的内标准品,即使你操作处理无误,有可能会把原本该得到的正确

结果,校正成一个错误的结果.

b.不要迷信内标准法的定量结果一定会优于外标法或线性回归法!

现在来看看一个我这边发生的一个实际例子:案例是由于实验室的某一项分析

由于注射入GC时浓度的需要,在SPE净化后需要不同的最终体积,一是1mL另一

是10mL,所以在这两组中基质的干扰,前者是后者的十倍,这个测试是使用空白

的样品在经过SPE净化后,调整体积至所需的体积,再添加入同样浓度的分析物标准

品及内标准品A,在正常的状况下,两者分析后所得的样品浓度应该是一样的!

体积为1mL的样品体积为10mL的样品标准品(无基质干扰)

内标峰面积54870.5040705.1042811.30分析物面积6224.906423.807164.38

计算后浓度649.90ug/g865.08ug/g1000ug/g两个样品很明显的都有受

到基值得干扰,1mL体积的样品所遭受的影响当然大于体积为10

mL的样品,但是A内标准无法把这种干扰校正回来,所以很明显的,A对于这

个分析方法,并不是一个适合的内标准品!

同样的方法,在使用B内标准时会产生以下的数据:

体积为1mL的样品体积为10mL的样品标准品(无基质干扰)

内标峰面积66423.4067859.4073846.70分析物面积6224.926243.807194.38

计算后浓度894.09ug/g859.15ug/g1000ug/g两个样品的回收率都超过

85%,样品之间的误差也不大……….所以最后修改SOP,把A换成了B!

一个分析要选择内标或外标的方式来进行定量,大概可以依照下述几个方面来

讨论..................

在前面我们讨论了第一个条件"适合的内标准品",现在继续下去!!

2.要考虑分析物的组成

平常的分析物一般大都是单一物质单一成分,也就是如农药中的Aldrine,这东

西当你在分析的时候,图谱上就仅仅会出现单一的一个波峰,某些东西会有结构异

构物,如BHC会有alpha,冷落 beta,gamma及sigma等四种形式的BHC.另外DDT也

是有一系列异构物出现,前述的那些分析物,再对内标物的选择和定量上,都不会

有太大的问题,但是,如果是多成分分析物时,不仅仅是内标物的选择,甚至于选

用外标或内标法定量,都必须特别的小心!!多氯联苯PCBs在环境或食品中都会有

它的踪迹,PCBs是个多成分的东西,商业化的PCBs多以AC1242,AC1016,

是多成分的,也就是说如果你以DB-5或DB-1的管柱来分离,都会获得数十支波峰,

至于多或少,那就要看分析员的功力和仪器的设定了.在这里我要讲的重点是,如

果今天是以内标法来分析PCBs,所面临的问题是分析物成分不止一个,甚至于多

到三十多个.....如果你要选择内标准品,势必要选择避免会和分析物产生重迭但性

质又不能差太多的内标准品,在这个例子中,并不见简单的事,在USEPA8082A

的方法中对于Aroclor的分析采用外标法,虽然外标法对于GC/ECD的检测十分不

利.但在同分析法中对PCBsCongeners(PCBs同源物,指的是单一成分PCB)即采

取内标法定量,内标准是使用十氯联苯或四氯间二甲苯.

在某些方法中你可以看到PCBsAroclor是以十氯联苯或四氯间二甲苯来作为

内标准品定量,之所以会使用这两种东西作为内标的原因是,十氯联苯是PCBs中

分子量最大,滞留时间当然也是最久,不会干扰到到其它PCBs的分析,但在实际

操作上会发现以十氯联苯作为内标准品,对于分子量较大的AC1260或

AC1254(AC1260及AC1254含氯数及分子量较接近十氯联苯)会有较准确的结果,

但对于AC1232或1242则较差.所以AC1242或AC1232的定量以四氯间二甲苯较

适宜,但是四氯间二甲苯的滞留时间不长(在AC1232出管柱前面,也因此不会干

扰PCBs定量),很容易受到基质中低分子量杂质的干扰,这个干扰再没有前处理净

化的状态下更严重,所以类似多成分的分析物在分析研发阶段,要采取内标或外标,

采取内标方法后要用甚么内标准品,都必须要多方考量才可以...多成分的东西其

实并不少,例如农药中的Toxaphene和Chlordane等都是......

内标法与外标法

一、内标法

什么叫内标法?怎样选择内标物?

内标法是一种间接或相对的校准方法。在分析测定样品中某组分含量时，加入

一种内标物质以校谁和消除出于操作条件的波动而对分析结果产生的影响，以提高

分析结果的准确度。

内标法在气相色谱定量分析中是一种重要的技术。使用内标法时，在样品中加

入一定量的标准物质，它可被色谱拄所分离，又不受试样中其它组分峰的干扰，只要测定内标物和待测组分的峰面积与相对响应值，即可求出待测组分在样品中的百

分含量。采用内标法定量时，内标物的选择是一项十分重要的工作。理想地说，内

标物应当是一个能得到纯样的己知化合物，这样它能以准确、已知的量加到样品中

去，它应当和被分析的样品组分有基本相同或尽可能一致的物理化学性质(如化学

结构、极性、挥发度及在溶剂中的溶解度等)、色谱行为和响应特征，最好是被分

析物质的一个同系物。当然，在色谱分析条什下，内标物必须能与样品中各组分充

分分离。需要指出的是，在少数情况下，分析人员可能比较关心化台物在一个复杂

过程中所得到的回收率，此时，他可以使用一种在这种过程中很容易被完全回收的

化台物作内标，来测定感兴趣化合物的百分回收率，而不必遵循以上所说的选择原

则。在使用内标法定量时，有哪些因素会影响内标和被测组分的峰高或峰面积的

比值?影响内标和被测组分峰高或峰面积比值的因素主要有化学方面的、色谱方面

的和仪器方面的三类。

由化学方面的原因产生的面积比的变化常常在分析重复样品时出现。化学方

面的因素包括:

1、内标物在样品里混合不好;

2、内标物和样品组分之间发生反应，

3、内标物纯度可变等。

对于一个比较成熟的方法来说，色谱方面的问题发生的可能性更大一些，色谱

上常见的一些问题(如渗漏)对绝对面积的影响比较大，对面积比的影响则要小一

些，但如果绝对面积的变化已大到足以使面积比发生显著变化的程度，同济大学分数线 那么一定有

某个重要的色谱问题存在，比如进样量改变太大，样品组分浓度和内标浓度之间有

很大的差别，检测器非线性等。进样量应足够小并保持不变，这样才不致于造成检

测器和积分装置饱和。如果认为方法比较可靠，而色谱固看来也是正常的话，应着

重检查积分装置和设置、斜率和峰宽定位。对积分装置发生怀疑的最有力的证据是:

面积比可变，而峰高比保持相对恒定，

在制作内标标准曲线时应注意什么?

在用内标法做色话定量分析时，先配制一定重量比的被测组分和内标样品的混

合物做色谱分析，测量峰面积，做重量比和面积比的关系曲线，此曲线即为标准曲

线。在实际样品分析时所采用的色谱条件应尽可能与制作标准曲线时所用的条件一

致，因此，在制作标准曲线时，不仅要注明色谱条件(如固定相、柱温、载气流速

等)，还应注明进样体积和内标物浓度。在制作内标标准曲线时，各点并不完全落

在直线上，此时应求出面积比和重量比的比值与其平均位的标准偏差，在使用过程

中应定期进行单点校正，若所得值与平均值的偏差小于2，曲线仍可使用，若大于

2，则应重作曲线，如果曲线在铰短时期内即产生变动，则不宜使用内标法定量。

二、外标法

用待测组分的纯品作对照物质，以对照物质和样品中待测组分的响应信号相比

较进行定量的方法称为外标法。此法可分为工作曲线法及外标一点法等。工作曲线

法是用对照物质配制一系列浓度的对照品溶液确定工作曲线，求出斜率、截距。在

完全相同的条件下，准确进样与对照品溶液相同体积的样品溶液，根据待测组分的

信号，从标准曲线上查出其浓度，或用回归方程计算，工作曲线法也可以用外标二

点法代替。通常截距应为零，若不等于零说明存在系统误差。工作曲线的截距为零

时，可用外标一点法(直接比较法)定量。

外标一点法是用一种浓度的对照品溶液对比测定样品溶液中i组分的含量。将

对照品溶液与样品溶液在相同条件下多次进样，测得峰面积的平均值，用下式计算

样品中i组分的量:

W,A(W),(A)

式中W与A分别代表在样品溶液进样体积中所含i组分的重量及相应的峰面

积。(W)及(A)分别代表在对照品溶液进样体积中含纯品i组分的重量及相应峰面积。外标法方法简便，不需用校正因子，不论样品中其他组分是否出峰，均可对待

测组分定量。但此法的准确性受进样重复性和实验条件稳定性的影响。此外，为了

降低外标一点法的实验误差，应尽量使配制的对照品溶液的浓度与样品中组分的浓

度相近。

外标法externalstandardmethod色谱分析中的一种定量方法，它不是把标

准物质加入到被测样品中，而是在与被测样品相同的色谱条件下单独测定，把得到

的色谱峰面积与被测组分的色谱峰面积进行比较求得被测组分的含量。外标物与被

测组分同为一种物质但要求它有一定的纯度，分析时外标物的浓度应与被测物浓度

相接近，以利于定量分析的准确性。三、定量分析中怎样选择内标法或外标法(来

源:药物分析网)

选一与欲测组分相近但能完全分离的组分做内标物(当然是样品中没有的组

分)，然后配制欲测组分和内标物的混合标准溶液，进样得相对校正因子。再将内

标物加入欲测组分的样品中，进样后测得欲测组分和内标物的定量参数。用内标法

公式计算即可。内标法是将一定量的纯物质作内标物，加入到准确称量的试样

中，根据被测试样和内标物的质量比及其相应的色谱峰面积之比，来计算被测组分

的含量。选择内标物有4个要求:1.内标物应是该试样中不存在的纯物质;2.它必

须完全溶于试样中，并与试样中各组分的色谱峰能完全分离;3.加入内标物的量应

接近于被测组分;4.色谱峰的位置应与被测组分的色谱峰的位置相近，或在几个被

测组分色谱峰中间。内标法的优点是测定的结果较为准确，由于通过测量内标物

及被测组分的峰面积的相对值来进行计算的，因而在一定程度上消除了操作条件等

的变化所引起的误差。内标法的缺点是操作程序较为麻烦，每次分析时内标物和试

样都要准确称量，有时寻找合适的内标物也有困难。外标法简便，但进样量要求

十分准确，要严格控制在与标准物相同的操作条件下进行，否则造成分析误差，得

不到准确的测量结果。内标与外标都是定量的一种方法而已，至于哪一种方法好

与不好不能一概而论，做不同的分析，面对着不同的要求，再加上分析成本分析效

率等等问题，我想简单而有效进行定量分析来满足要求才是最重要的。

1、以前做过很多医药、农药中间体的芳香族卤代化合物的常量定量分析，没

有自动进样器，

用外标法定量，确实重现性与稳定性非常差，结果经常受到搞合成同事的质

疑。其实，

仔细分析原因不一定就是外标法不适合这种定量分析，首先我们的实验室仪器

和手段是

否调整到一种稳定而合理的状态了，比如，衬管是否洁净，玻璃棉的位置是否

合适恰当

(能否使样品尽可能的汽化)、汽化温度是否合适、色谱峰形是否对称(也就是

样品与

色谱柱健合相是否匹配)、附近有没有其它色谱峰的干扰、选用什么进样方式

(如快速

进样还是热针进样)等等因素的影响都需要考虑，如果这些因素都考虑了，按

照GMP

方法验证对于精密度的要求，同一样品进6针以上的RSD和配制6个样品的定

量结果

RSD都能满足小于1.5%的要求，那么这个方法用外标法就是完全适用的，但是

前面的

影响因素是一定要都考虑到的，否则谈论这个方法是否适用就有失偏颇了。在

做过的许

多出口产品的定量分析方法当中有许多是一些医药公司提供的比较完善而验证

过的方

法，内标与外标都有(他们用的都是自动进样)精密度都能满足RSD小于1.5%的

要求，

当一个方法能够满足测试要求的时候，无论内标外标，都是可行的，当然有一

个分析成

本和分析时间的问题，内标的成本和控制溶液、样品溶液的配制当然要比外标

要高和麻

烦一些了。而有些时候，可能受你实验室现有仪器和附属设备的影响，达不到

一定的要

求，而还必须进行定量分析，有时外标的结果可能先手围棋 就要差一些，这时，你可能

就要考虑

用内标法了，可以排除手动进样的误差、分流歧视的影响、包括一些未知因素

平行误差

的影响，这时内标可能就显示出它的优势来了。

2、上面已经提到当做方法验证的时候，当同一样品配制6个样品溶液用所选

用的外标

法进行定量的时候，RSD都满足1.5%的要求时，也分为两种情况，小于1%和大

于1%

小于1.5%。如果RSD的结果小于1%，那这个方法就没有什么可以怀疑的了;如

果RSD

的结果大于1%而在1.5%略低一些的范围活动时，这个方法的可行性就将受到

质疑，毕

竟这是方法验证，你就要考虑上面1所提到的影响因素的影响了，如果排除掉

以上的影

响因素，RSD还是在1.5%附近，就要尝试内标了，如果内标结果的RSD很好，

就证

明你的这个方法受实验条件的影响很大，只能用内标了，或者干脆将原方法做

大的变动，

再尝试用外标法测试。

3、而对于微量分析，比如农药和兽药残留的分析、环境分析等，根据不同的

限量标准

要求对于精密度的要求也比常量分析的要求要宽松的多，RSD有时可以允许达

到10%

甚至更高，这时可能外标法有更大的应用空间。

4、单从精密度方面去考虑，排除其它成本和效率的因素，个人认为还是内标

优于外标。

曾经做过一个中间体二氨基丙醇的常量定量分析，以二乙醇胺为内标，RTX-5

amine(碱

改性)15m*0.32mm*1.0um色谱柱分析，将配制好的控制溶液(含有内标物)自动

进

样器进6针，目的物(二氨基丙醇)与内标物(二乙醇胺)峰面积比率的RSD为

0.18%，

而只对这六针样品的目的物峰(二氨基丙醇)面积求RSD，结果为0.71%，通过

这一

实例的结果大家就会发现到底哪个方法精密度更好了，当然是内标更好了。当

然这个化

合物的检测方法最后根据上面的验证数据用内标和外标定量都是可以的，实验

室可以自

由选择。但内标与外标精密度结果的差异是显然存在的事实。

结论:应用外标法能够满足要求，首选还是外标法了，毕竟简单而省事。对于

精密度要

求比较高、结果准确度会产生重大影响、实验室条件不是很理想的等等条件

下，用内标

法还是必要的。无论应用那种方法，方法的验证和确认都是很重要的，只要是

按照程序

经过验证和确认的方法，都有其应用的空间的。

什么叫内标法?怎样选择内标物?

内标法是一种间接或相对的校准方法。在分析测定样品中某组分含量时，加入

一种内标物质以校谁和消除出于操作条件的波动而对分析结果产生的影响，以提高

分析结果的准确度。内标法在气相色谱定量分析中是一种重要的技术。使用内标

法时，在样品中加入一定量的标准物质，它可被色谱拄所分离，又不受试样中其它

组分峰的干扰，只要测定内标物和待测组分的峰面积与相对响应值，即可求出待测

组分在样品中的百分含量。采用内标法定量时，内标物的选择是一项十分重要的工

作。理想地说，内标物应当是一个能得到纯样的己知化合物，这样它能以准确、已

知的量加到样品中去，它应当和被分析的样品组分有基本相同或尽可能一致的物理

化学性质(如化学结构、极性、挥发度及在溶剂中的溶解度等)、色谱行为和响应特

征，最好是被分析物质的一个同系物。当然，在色谱分析条什下，内标物必须能与

样品中

各组分充分分离。需要指出的是，在少数情况下，分析人员可能比较关心化台

物在一个复杂过程中所得到的回收率，此时，他可以使用一种在这种过程中很容易被完全回收的化台物作梅贻琦 内标，来测定感兴趣化合物的百分回收率，而不必遵循以上

所说的选择原则。在使用内标法定量时，有哪些因素会影响内标和被测组分的峰

高或峰面积的比值?

影响内标和被测组分峰高或峰面积比值的因素主要有化学方面的、色谱方面的

和仪器方面的三类。

由化学方面的原因产生的面积比的变化常常在分析重复样品时出现。

化学方面的因素包括:

1、内标物在样品里混合不好;

2、内标物和样品组分之间发生反应，

3、内标物纯度可变等。

对于一个比较成熟的方法来说，色谱方面的问题发生的可能性更大一些，色谱

上常见的一些问题(如渗漏)对绝对面积的影响比较大，对面积比的影响则要小一

些，但如果绝对面积的变化已大到足以使面积比发生显著变化的程度，那么一定有

某个重要的色谱问题存在，比如进样量改变太大，样品组分浓度和内标浓度之间有

很大的差别，检测器非线性等。进样量应足够小并保持不变，这样才不致于造成检

测器和积分装置饱和。如果认为方法比较可靠，而色谱固看来也是正常的话，应着

重检查积分装置和设置、斜率和峰宽定位。对积分装置发生怀疑的最有力的证据是:

面积比可变，而峰高比保持相对恒定，

在制作内标标准曲线时应注意什么?

在用内标法做色谱定量分析时，先配制一定重量比的被测组分和内标样品的混

合物做色谱分析，测量峰面积，做重量比和面积比的关系曲线，此曲线即为标准曲

线。在实际样品分析时

所采用的色谱条件应尽可能与制作标准曲线时所用的条件一致，因此，在制作

标准曲线时，不仅要注明色谱条件(如固定相、柱温、载气流速等)，还应注明进样体积和内标物浓度。在制作内标标准曲线时，各点并不完全落在直线上，此时应求

出面积比和重量比的比值与其平均位的标准偏差，在使用过程中应定期进行单点校

正，若所得值与平均值的偏差小于2，曲线仍可使用，若大于2，则应重作曲线，

如果曲线在铰短时期内即产生变动，则不宜使用内标法定量。

外标法

用待测组分的纯品作对照物质，以对照物质和样品中待测组分的响应信号相比

较进行定量的方法称为外标法。此法可分为工作曲线法及外标一点法等。工作曲线

法是用对照物质配制一系列浓度的对照品溶液确定工作曲线，求出斜率、截距。在

完全相同的条件下，准确进样与对照品溶液相同体积的样品溶液，根据待测组分的

信号，从标准曲线上查出其浓度，或用回归方程计算，工作曲线法也可以用外标二

点法代替。通常截距应为零，若不等于零说明存在系统误差。工作曲线的截距为零

时，可用外标一点法(直接比较法)定量。外标一点法是用一种浓度的对照品溶液

对比测定样品溶液中i组分的含量。将对照品溶液与样品溶液在相同条件下多次进

样，测得峰面积的平均值，用下式计算样品中i组分的量:

W,A(W),(A)

式中W与A分别代表在样品溶液进样体积中所含i组分的重量及相应的峰面

积。(W)及(A)分别代表在对照品溶液进样体积中含纯品i组分的重量及相应峰面

积。外标法方法简便，不需用校正因子，不论样品中其他组分是否出峰，均可对待

测组分定量。但此法的准确性受进样重复性和实验条件稳定性的影响。此外，为了

降低外标一点法的实验误差，应尽量使配制的对照品溶液的浓度与样品中组分的浓

度相近。

外标法externalstandardmethod色谱分析中的一种定量方法，它不是把标

准物质加入到被测样品中，而是在与被测样品相同的色谱条件下单独测定，把得到

的色谱峰面积与被测组

分的色谱峰面积进行比较求得被测组分的含量。外标物与被测组分同为一种物

质但要求它有一定的纯度，分析时外标物的浓度应与被测物浓度相接近，以利于定

量分析的准确性。定量分析中怎样选择内标法或外标法

选一与欲测组分相近但能完全分离的组分做内标物(当然是样品中没有的组

分)，然后配制欲测组分和内标物的混合标准溶液，进样得相对校正因子。再将内

标物加入欲测组分的样品中，进样后测得欲测组分和内标物的定量参数。用内标法

公式计算即可。内标法是将一定量的纯物质作内标物，加入到准确称量的试样

中，根据被测试样和内标物的质量比及其相应的色谱峰面积之比，来计算被测组分

的含量。选择内标物有4个要求:1.内标物应是该试样中不存在的纯物质;2.它必

须完全溶于试样中，并与试样中各组分的色谱峰能完全分离;3.加入内标物的量应

接近于被测组分;4.色谱峰的位置应与被测组分的色谱峰的位置相近，或在几个被

测组分色谱峰中间。内标法的优点是测定的结果较为准确，由于通过测量内标物

及被测组分的峰面积的相对值来进行计算的，因而在一定程度上消除了操作条件等

的变化所引起的误差。内标法的缺点是操作程序较为麻烦，每次分析时内标物和试

样都要准确称量，有时寻找合适的内标物也有困难。外标法简便，但进样量要求

十分准确，要严格控制在与标准物相同的操作条件下进行，否则造成分析误差，得

不到准确的测量结果。内标与外标都是定量的一种方法而已，至于哪一种方法好

与不好不能一概而论，做不同的分析，面对着不同的要求，再加上分析成本分析效

率等等问题，我想简单而有效进行定量分析来满足要求才是最重要的。

1、以前做过很多医药、农药中间体的芳香族卤代化合物的常量定量分析，没

有自动进样器，用外标法定量，确实重现性与稳定性非常差，结果经常受到搞合成

同事的质疑。其实，仔细分析原因不一定就是外标法不适合这种定量分析，首先我

们的实验室仪器和手段是否调整到一种稳定而合理的状态了，比如，衬管是否洁

净，玻璃棉的位置是否合适恰当(能否使样品尽可能的汽化)、汽化温度是否合适、

色谱峰形是否对称(也就是样品与色谱柱健合相是否匹配)、附近有没有其它色谱峰

的干扰、选用什么进样方式(如快速进样还是热针进样)等

等因素的影响都需要考虑，如果这些因素都考虑了，按照GMP方法验证对于精

密度的要求，同一样品进6针以上的RSD和配制6个样品的定量结果RSD都能满足

小于1.5%的要求，那么这个方法用外标法就是完全适用的，但是前面的影响因素

是一定要都考虑到的，否则谈论这个方法是否适用就有失偏颇了。在做过的许多出

口产品的定量分析方法当中有许多是一些医药公司提供的比较完善而验证过的方

法，内标与外标都有(他们用的都是自动进样)精密度都能满足RSD小于1.5%的要

求，当一个方法能够满足测试要求的时候，无论内标外标，都是可行的，当然有一

个分析成本和分析时间的问题，内标的成本和控制溶液、样品溶液的配制当然要比

外标要高和麻烦一些了。而有些时候，可能受你实验室现有仪器和附属共青团组织原则 设备的影

响，达不到一定的要求，而还必须进行定量分析，有时外标的结果可能就要差一

些，这时，你可能就要考虑用内标法了，可以排除手动进样的误差、分流歧视的影

响、包括一些未知因素平行误差的影响，这时内标可能就显示出它的优势来了。

2、上面已经提到当做方法验证的时候，当同一样品配制6个样品溶液用所选

用的外标法进行定量的时候，RSD都满足1.5%的要求时，也分为两种情况，小于

1%和大于1%小于1.5%。如果RSD的结果小于1%，那这个方法就没有什么可以怀疑

的了;如果RSD的结果大于1%而在1.5%略低一些的范围活动时，这个方法的可行性

就将受到质疑假如给我三天光明好词好句摘抄 ，毕竟这是方法验证，你就要考虑上面1所提到的影响因素的影响

了，如果排除掉以上的影响因素，RSD还是在1.5%附近，就要尝试内标了，如果内

标结果的RSD很好，就证明你的这个方法受实验条件的影响很大，只能用内标了，

或者干脆将原方法做大的变动，再尝试用外标法测试。

3、而对于微量分析，比如农药和兽药残留的分析、环境分析等，根据不同的

限量标准要求对于精密度的要求也比常量分析的要求要宽松的多，RSD有时可以允

许达到10%甚至更高，这时可能外标法有更大的应用空间。

4、单从精密度方面去考虑，排除其它成本和效率的因素，个人认为还是内标

优于外标。曾经做过一个中间体二氨基丙醇的常量定量分析，以二乙醇胺为内标，

RTX-5amine(碱改

性)15m*0.32mm*1.0um色谱柱分析，将配制好的控制溶液(含有内标物)自动进

样器进6针，目的物(二氨基丙醇)与内标物(二乙醇胺)峰面积比率的RSD为

0.18%，而只对这六针样品的目的物峰(二氨基丙醇)面积求RSD，结果为0.71%，通

过这一实例的结果大家就会发现到底哪个方法精密度更好了，当然是内标更好了。

当然这个化合物的检测方法最后根据上面的验证数据用内标和外标定量都是可以

的，实验室可以自由选择。但内标与外标精密度结果的差异是显然存在的事实。

结论:应用外标法能够满足要求，首选还是外标法了，毕竟简单而省事。对于

精密度要求比较高、结果准确度会产生重大影响、实验室条件不是很理想的等等条

件下，用内标法还是必要的。无论应用那种方法，方法的验证和确认都是很重要

的，只要是按照程序经过验证和确认的方法，都有其应用的空间的。

外标法

用被测化合物的纯品作为标准样品，配制成一系列的已知浓度的标样。注入

色谱柱的到其响应值(峰面积)。

在一定范围内，标样的浓度与响应值之间存在较好的线性关系，即W=fA，制

成标准曲线。在完全相同的实验条件下，注入未知样品，得到欲测组分的响应

值。

根据已知的系数f，即可求出欲测组分的浓度。

外标法的优点:

操作、计算简单，是一种常用的定量方法。

无需各组分都被检出、洗脱。

需要标样。

标样及未知样品的测定条件要一致。

进样体积要准确。

内标法操作:

将已知量的内标样加入标准样品，制成混合标样，并配制一系列的已知浓度的

工作标样。混合标样中标样与内标样的摩尔比不变。

注入色谱柱，以(标样峰面积/内标样峰面积)为响应值。

根据响应值与工作标样浓度之间存在的线性关系，即W=fA，制成标准曲线。

将已知量的内标样加入未知样品，注入色谱柱，得到欲测组分的响应值。根据已

知的系数f，即可求出欲测组分的浓度。

内标法的特点:

操作过程中样品和内标是混合在一起注入色谱柱的，因此只要混合溶液中被测

组分与内标的量的比值恒定，上样体积的变化不会影响影响定量结果。

内标法抵消了上样体积，乃至流动相、检测器的影响，因此比外标法精确。