毕赤酵母电转化方法及转化子的筛选
菌体的准备:
1. 挑取酵母单菌落,接种至含有５ml YPＤ 培养基的50ml 三角瓶中，30℃、２50－300r／min培养过夜;
2． 取100-5０0µl (≤1:100)的培养物接种至含有50ml 新鲜培养基的200ｍＬ三角摇瓶中，28~30℃、250-30０r/ｍｉn培养过夜 (约2０h),至ＯＤ60０ 达到１.3~1.5;
3． 将细胞培养物于４℃，1500g 离心５miｎ,用50ml 的冰预冷的无菌水将菌体沉淀重悬；
４. 按步骤3 离心,用２5ml的冰预冷的无菌水将菌体沉淀重悬
５． 按步骤3 离心,用２-5ml,1M的冰预冷山梨醇溶液将菌体沉淀重悬；
６. 按步骤３ 离心，用１60µl的冰预冷的1moｌ的山梨醇溶液将菌体沉淀重悬，其终体积约为240 ul;
工作态度和责任心总结
备注：可将其分装为８0 µl 一份的包装-70冷冻起来，２周之内使用,但会影响其转化效率。
比如常见的pPIC9Ｋ的载体转GＳ115一般先用MD平板初筛,然后长出的克隆子可以挑到不同浓度的含G４１８抗性的YPＤ平板上筛选高拷贝。对正确筛选出的单菌落接YPD小瓶摇活后，转大瓶ＢMGY摇瓶发酵。一般对于甲醇诱导菌株，摇瓶一天左右后开始补加甲醇，就类似BMMY的功能了。
✓KM71冬瓜糖的做法比GＳ11５生长的要慢。毕赤酵母都应该是白色菌落的
✓对于LＯX家族蛋白的表达，可尝试在酵母培养基中加入 Ｃｕ2+ 离子，提高表达量和蛋白活性?
菌种保存:
挑单克隆到YPD中培养1８-2４ｈ,然后取菌液以１:1加入30%灭菌甘油， -8０ｏC 拯救我们的城市ul/管冻存
（一般用10ｕｇ以上质粒用ＳalI酶切，然后直接加乙醇沉淀，７０%乙醇洗一遍,约20ul ｄdH2O重溶。转化效率一般大于100个克隆每ugDNA。建议你不要用胶回收kｉt，回收的DＮA可能还有盐，导致电击时放电时间很短。
乙醇沉淀主要步骤如下:
1）酶切体系(８０ul）中2倍体积的无水乙醇加1/1０体积的PH5.２ NaAC,混匀ﻫ２）-20℃ 20分钟沉淀ﻫ３)1３2０0rpm,２0min,离心后弃上清ﻫ4）７5%乙醇3０0uｌ轻轻洗,同上离心５ｍin，弃上清
5)３７ 度烘箱至无乙醇气味（或是用摇床的出风口吹出的暖风吹）。ﻫ6)20ul ddH2O重溶）
电击转化:
8. 将５~20 µ ｇ 的线性化DNA 溶解在5~10 µ l TE溶液中，与80 µ l 的上述步骤６ 所得的菌体混匀,转至0.2cm 冰预冷的电转化杯中；
9． 将电转化杯冰浴5miｎ;
10． 根据电转化仪提供的资料，参考其他文献及多次摸索，确定合适的电压、电流、电容等参数，按优化的参数，进行电击;
１1. 电击完毕后，马上加入1ml 1Ｍ的冰预冷的山梨醇溶液将菌体混匀，转至1.5ml 的ＥP管中；（置于30度摇床低速培养1h，再涂板)
12. 将菌体悬液涂布于MＤ平板上,每２0０~６00 µ l 涂布一块平板；
1３. 将平板置于30℃倒置培养，直至单个菌落出现 (3-4天)。
推荐：电压1.5kＶ ;电容２5µF ;电阻2００ Ω。电击时间为4 ~１0ｍc。
Ｐｉchia酵母表达直接PCＲ鉴定重组子的方法
五陵豪杰1.平板上的菌落长到肉眼可见时(约12小时)；
2.取1ｍl酵母悬液4000rmp离心，pbｓ重悬，煮沸５mins,放到冰上５minｓ,直接就可以用做pcｒ的模板了
3.将除了模板之外的其它ＰCR反应液的组分准备好,并分装。
３． 用灭菌的牙签挑取菌落，在PCR管中涮一下， ＰCＲ扩增，
利用5’AOX 1和3’ＡＯX １引物对转化子进行PＣＲ复筛,同时检测基因插入(如果重组质粒以单交换的方式整合到Ｐｉcｈia paｓtorｉｓ基因组，则会扩增到两条带，一条为2.2kｂ(KM７1为３.6kｂ)宿主茵AOＸI基因,另一条为包括目的基因和成熟肽序列和a-factoｒ信号肽序列的片段。)
Eａch 50 µｌ aliqｕot of competenｔ Pichia ｃｅlls with 3 µｇ linｅａrizeｄ pｌaｓmid ＤNA wiｌl ｙield 50 coｌonｉes on lectiｖe medium.
Mｕｔｓ 表型重组酵母的诱导表达实验
As ａ ｇeｎerａl ruｌｅ wheｎ iｎducing ｅxｐｒeｓsｉon, ｎever ａllｏw ｃultuｒes tｏ ｂe ｍoｒe than 10-30% of ｙｏur total ｆlask ｖoｌｕｍｅ．
1. 挑选一单菌落,置于装有5０ｍl MGY、BMG 或ＢMGY培养基的50０ml 摇瓶中，于28－3０中班绘画°C ／2５0－３00 ｒpm 培养至OD600 = 2－６ (~1６-１８ ｈ）;
2. 室温下１５0０~300０ｇ 离心５mｉｎ,收集菌体，用１/5到1／1０原培养体积的MM, ＢMM或 BＭMY重悬菌体(约2.5~5ｍl ）；
3. 将步骤2 所得的菌液置于10０ｍl 的摇瓶中，用双层纱布或粗棉布封口，放置于2８－３０ °
C／２5０－300 rpｍ 的摇床上继续生长;
4. 每2４h 向培养基中添加１00 ％甲醇至终浓度为0.５ ~1.０%；
5. 按时间点分别取菌液样品,取样量为1ｍｌ,置于１.５mｌ EＰ 管中,最大转速离心2~３min ，分别收集上清和菌体，分析目的蛋白的表达量和菌液最佳收获时间。时间点一般取：０ 、２4、48、72、96和１2０h；
6． 对分泌表达,分离样品的上清液；对胞内表达,分离样品的菌体沉淀，带检测样品用液
氮或干冰速冻后,于－80 °Ｃ 保存备用；
７. 可以用ＳDS-PAＧE、Western-Ｂloｔ及活性实验检测与鉴定重组蛋白的表达。
Muｔ+表型重组酵母的诱导表达实验
１． 挑选一单菌落,置于装有25ml MGＹ、BMG或BMGY培养基的２50ｍl摇瓶中，于28-30°C/250-30０ rpｍ培养至OD６０0 = 2-６ (～16-18 h)；
2. 室温下1500~３000ｇ离心5mｉn,收集菌体，用ＭM、BＭM或 BMMY重悬菌体，使OＤ600 =1．0左右（约１00~200ml）；
3． 将步骤2所得的菌液置于1Ｌ的摇瓶中，用双层纱布或粗棉布封口,放置于28-30°C/２50-３00 rpm的摇床上继续生长;
4. 每２4ｈ向培养基中添加１00％ 甲醇至终浓度为０.５～1.0%；
5. 按时间点分别取菌液样品，取样量为１ｍl，置于１．5ml EP管中,最大转速离心2~3min,分别收集上清和菌体，分析目的蛋白的表达量和菌液最佳收获时间。时间点一般取：0、6、12、24、36、4８、60、7２、84和９6h;
６． 对分泌表达，分离样品的上清液；对胞内表达,分离样品的菌体沉淀,带检测样品用液氮或干冰速冻后，于-80°C保存备用；
出行攻略
７． 可以用SDＳ-ＰAGＥ、Westerｎ-Blot及活性实验检测与鉴定重组蛋白的表达。
单杠练腹肌BMＧＹ和ＢＭMY的换液方式有2种：
1）一种是离心换液,即在生长培养结束后,转移到灭菌大离心管中,４0０0rpm室温离心5分钟后，用ＢMMY洗下菌体,再转移到摇瓶,整个过程均用灭菌移液管操作。
2）另一种是静止换液,即在生长培养结束后,将摇瓶在无菌室静止4小时后，直接在酒精灯旁倾倒培养液,再加入诱导培养基,此种方法的缺点有少量生长培养基残留。
是离心换液或者静止换液,到底那个好,只有根据自己的实验结果来考量。如果只是从防治污染的角度来说，静止换液也好一些，因为操作毕竟少一些，速度也快。
家长评语用新开启的分析纯甲醇,一直放在无菌室里面，每次直接用灭菌ＴＩP吸取加入摇瓶就可以了。也有人试过用膜过滤，结果膜都溶解了。
菌体是在BMMY中培养的，可以不用BＭＭＹ做对照，在6０0nm处测OＤ值，培养基和ＰＢS光吸收都很低,PＢＳ更方便。
麦芽浸提液培养酵母（不换液，补料）,生长阶段结束后,密度可达到10-12,诱导培养结束后，密度可达到１8左右。
如果用1体积的ＢMGＹ，在生长阶段结束后，换液时,加入1/10－1/2体积的ＢMMY进行诱导培养(即浓缩培养），细胞密度也可达到20以上。
通常,真正的高密度发酵只有在发酵罐里才能实现，OＤ600可达到40-６０及以上。摇瓶很难达到那样的密度，不过可以采取浓缩培养的方式实现高密度。
摇瓶不能像发酵罐那样保证通气量，但可以通过装量来暂时替代这个指标。
Muｔ+/Muｔｓ 的筛选
用Ｓaｃ I,Sａｌ I or Sｔu I 线性化插入ＨIS４ 位点的载体转化GS1５5后,多数转化子应为Mut+，但也有Hiｓ＋Mutｓ的转化子存在(见Invitrｏｇen ｐroｔｏcｏl p36），Ｎot Ｉ oｒ Bgl IＩ线性化插入AOX I位点的载体转化GS15５后，用MD/MM平板可区分Ｍut+/Muｔｓ。
Usｅ ｔｈｅ pｌaｔes cｏntａinｉng the Hｉｓ+ tｒansｆormaｎｔs and screｅn ｆｏr tｈｅ Mut+ ａnｄ MutS phｅnoｔyｐe ａｓ ｄescribｅｄ bｅlｏw.
1. Ｕsing a stｅrilｅ ｔｏothpick， pｉcｋ one cｏlony and sｔreak ｏr patch one Hｉs+ trａnsformanｔ ｉｎ a rｅｇｕｌar patteｒn on botｈ an MM pｌaｔe anｄ an ＭD ｐlate, ｍaking sｕｒe to patch tｈe MM pｌate firsｔ.
2. Ｕ ａ ｎeｗ toｏthpick ｆor each ｔrａnsforｍant and ｃｏｎtinue untｉl １00 trａnｓformａnts have ｂeeｎ patchｅd (2－３ ｐlates)．
3. Ｔo differentｉａtｅ Mut+ frｏm ＭｕtS, ｍakｅ ｏne patch for eaｃh of tｈe contｒols (GS1１5/His+ MｕtS Aｌbｕmin anｄ GS11５／Ｈｉs+ Mut+ β -ｇal) ontｏ the MD and MＭ plａｔes．
4. Incuｂate ｔhe ｐｌates at 30°Ｃ fｏr 2 days.
5. Aｆter ２ daｙs or ｌonger at ３0°C, ｓcore tｈe ｐlａtes. Mut＋ traｎsformaｎts ｗill grow well on bｏｔh ＭD and MＭ plａtes． MutＳ trａnｓfｏrmants will gｒoｗ ｗｅll ｏn MＤ plateｓ, ｂut shｏw littｌe ｏr no growth ｏn ｔhe MM plaｔes.
