热原的去除及验证
热原(Pyrogens)是微生的代谢产物。大多数细菌都能产生，致热能力最强的是革兰氏阴性杆菌所产生的热原。霉菌甚至病毒也能产生热原。
含有热原的输液注入人体，大约半小时以后，就使人体发冷、寒战、体温升高、身痛、出汗、恶心呕吐等不良反应，有时体温可升至40哥哥好棒℃，严重者出现昏迷、虚脱，甚至有生命危险。
热原反应的温度变化曲线，因热原种类不同而有差异。一般先经过一个短的潜伏期后，温度略微上升，然后又略微下降，接着又很快上升，并出现一个高峰，根据这种现象而导致一个假设：即细菌性热原本身不引起发热反应。但热原使多型核白细胞(polymorphonucler leucocyte)及其他细胞释放一种内源性热原(endogenous pyrogen)，虽然有人提出内源性热原可能是蛋白质或脂蛋白(lipoprotein)组成，但其确切组成尚未肯完，它作用于视丘下部体温调节中枢，可能引起5-羟色胺的升高而导致发热[1]，热原的致热量因菌种而异，由于注射途径不同，引起发热反应的程度也有差异。
1.热原的组成
热原是微生物的一种内毒素，它存在于细菌的细胞膜和固体膜之间。内毒素是由磷脂、脂多糖和蛋白质所组成的复合物，其中脂多糖(lipopolysaccharide)是内毒素的主要成分，具有特别强的热原活性，因而大致可以认为内毒素=热原=脂多糖。脂多糖的化学组成因菌种不同而异，从大肠杆菌分出来的脂多糖中有68%～69%的糖(葡萄糖、半乳糖、庚糖、氨基葡萄糖、鼠李糖等)，12～13%的类脂化合物，7%的有机磷和其它一些成分。热原的分子量一般为10105
左右。
热原的结构
2.热原的性质(1)耐热性
一般说来，热原在60℃加热1小时不受影响，100℃也不会发生热解，在180℃3～4小时，250℃30～45分钟或650℃1分钟可使热原彻底破坏。虽然已经发现某些热原具有热不稳定性，但在通常注射剂灭菌的条件下，往往不足以使热原破坏，这点必须引起注意；
(2)滤过性
热原体积小，约在1～提防的近义词5nm之间，故一般滤器均可通过。即使微孔滤膜，也不能截留。但活性炭可以吸附热原；
(3)水溶性
热原能溶于水；
(4)不挥发性
热原本身不挥发，但在蒸馏时，往往可随水蒸汽雾滴带入蒸馏水，故应设法防止；
(5)吸附性
热原对许多分子有亲和性，优其是蛋白质类，因此较难去除。
(5)其它
热原能耐受酸碱和化学试剂的处理，但热原能被强酸、强碱破坏，也能被强氧化剂如高锰酸钾或过氧化氢所钝化，超声波也能破坏热原。热原对干涸的耐受性较强。
3.污染热原的途径(1)从溶剂中带入
这是注射剂出现热原的主要原因。蒸馏器结构不合理，操作不当，注射用水贮藏时间过长都会污染热原。故应使用新鲜注射用水，最好随蒸随用；
(2)从原料中带入
容易滋长微生物的药物，如葡萄糖因贮存年久包装损坏常致污染热原。用生物方法制造的药品如右旋糖酐、水解蛋白或抗生素等常因致热物质未除尽而引起发热反应；
(3)从容器、用具、管道和装置等带入
因此在生产中对这些容器用具等物要认真处理，合格后方能使用；
(4) 制备过程中的污染
制备过程中，由于室内卫生条件差，操作时间长，装置不密闭，均增加污染细菌的机会，而可能产生热原；
(5)从输液器带入
英语短文有时输液本身不含热原，但仍发现热原反应。这往往是由于输液器具(如输液吊瓶、胶皮管等)污染所致。
4. 热原的除去方法
除热原的定义是除去所有使病人体温升高的物质。制药生产中指除去内毒素。除热原的方法主要有物理去除，钝化。
物理去除法包括反渗透法、蒸馏法、超滤法、活性炭吸附法、疏水性吸附法、静电修饰过滤法、吸附色谱法、用粘合剂或色谱柱提取、漂洗。
（1）蒸馏法
水系统中使用的最古老的方法。机理简单，包括水的双相转变，沸点使液体变为蒸气，蒸气挥发，分子量大的热原被留下，设计良好的隔析使气体凝固，重力使其下降，使热原的分子量加大。通常需要 >80oC再循环温度。
（2）超滤法
超滤的原理通常认为是分子筛，其有效性与筛的大小有关。LPS 的分子量约为 10,000 -20,000道尔顿，因此可以被10,000道尔顿的超滤膜除去。实际上热原聚合物的分了量约100,000道尔顿,所以0.1 um的滤膜通常能有效的除去热原。
（3）活性炭吸附法
古老的方法之一，很早就有文献记载。活性炭对热原有较强的吸附作用，同时有助滤脱色作用，所以在注射剂中使用较广。常用量为0.1%～0.5%。此外还可用活性炭与白陶土合用除去热原。活性炭适用的pH范围较宽，不受电解质浓度影响。这种方法在制剂应用较广，如生理盐水，葡萄糖和抗生素等的除热原。缺点是对某些活性成份有吸附。
（4）疏水吸附法
名人作文素材很多的脂肪族聚合物对热原有吸附性，聚丙烯，聚乙烯，聚偏二乙烯，聚四氟乙烯。这些聚合物的非极性基团使滤膜有疏水性。膜和脂多糖A之间的疏水吸附是溶液中的热原被吸附的原因。
（5）静电修饰过滤
这种滤膜利用两种作用方式：pH >2.0时原热带负电其行为像阴离子，因此滤膜中使用阳离子吸附热原。也利用滤膜中纤维分支与热原的碰撞、沉积、筛分来捕获热原。这些滤膜通常较厚，也有一些仅带正电的滤膜。
（6）吸附色谱法
这是一个应有较广的方法，吸附剂包括Polymixin B，Substrate AnalogueSepharo，原则性与灵活性LAL Sepharo，DEAE Sepharo。Sepharo色谱柱可以在很长的时间内保留吸附能力。并能用1% sodium deoxycholate再生。
（7）粘合剂提取法
有很多化学物的特性可用以实验，优其是热原的检查，最近Profos AG使用相技术提取热原。但大多数的这些粘合系统不适合于大规模的应用而只能用于实验。
(8) 用反渗透法通过三醋酸纤维膜除去热原
这是近几年发展起来有实用价值的新方法。反渗透膜是很薄的纤维或聚酰胺膜，通过分子筛的形式阻碍原热聚合物通过滤膜，因为这样某些产品的使用有所限制。良好的反渗透膜可以去除99.5% - 99.9%的热原，即使负荷达 10,000 EU/ml。常见的问题是膜穿孔。
（9）漂洗法
严格来说漂洗不是除热原的方法，但是在很多情况下能成功的除去小量的热原。注射用水清洗系统经常用于处理大容器，管道。热和超声可以提高效率。由于其内在的变化性，漂洗程序要仔细的验证。
钝化法
(10) 春熙路美食离子交换法
国内有用#301弱碱性阴离子交换树脂10%与#122弱酸性阳离子交换树脂8%成功地除去丙种胎盘球蛋白注射液中的热原；孔子的智慧
(11) 凝胶滤过去
国内有用二乙氨基乙基葡聚糖凝胶(分子筛)制备无热原去离子水；
钝化包括热、湿和干，化学钝化和部分破坏，氧化（H2O2）。
（12）干热除热原
对于注射用的针筒或其他玻璃器皿，在洗涤干燥后，于250℃加热30分钟以上，可以破坏热原；需要验证说明热原的3个对数下降。要求进行热原挑战性试验，例如用热原挑战瓶子和ECVs 来建立干热除热原过程导致的热原的对数下降。
（13）酸碱化学钝化
玻璃容器、用具还可用重铬酸钾硫酸清洁液或稀氢氧化钠处理，可将热原破坏；酸水解作用于酸不稳定的ketosidic链，使Lipid-A从热原分子中分离。KDO和核心polysaccharides是
整个分子中脂部分的绝以载体。一旦出现分离，脂多糖A不溶于水，热原活性下降或消失。碱水解靠脂肪酸的皂化，使热原分子发生化学和生化变化。一般来说碱水解的效力低于酸水解， 0.25N NaOH ， 56oC， 1 hour仅能中度破坏热原。加入95% 乙醇或 80% dimethylsulfoxide可以提高效果，但工艺难于处理不能广泛应用。
（14）过氧化氢
早在1912 Hort & Penfold证实用双氧水清洗后Salmonella Typhosa细菌失去致热能力。双氧水对热原的作用机理未明。可能是脂多糖A过氧化所致。热可以增加过氧化氢的作用。本法优于酸碱法，但可能使产品变质。
(四) 原水处理原水处理方法有离子交换法与电渗析法及反渗透法，离子交换法制得的离子交换水主要供蒸馏法制备注射用水使用，也可用于洗瓶，但不得用来配制注射液，因其在除热原方面还不如蒸馏法那样可靠，有时还带有乳光。电渗析法与反渗透法广泛用于原水预处理，供离子交换法使用，以减轻离子交换树脂的负担。
前面已提到,热原是微生物污染产生的致热物质，是病人注射后发热反应的根源。这些致热物质是菌菌外壁的脂多糖或内毒素。由于它的耐热性，灭菌后或过滤后仍可以水中存在。
注射用水应采用合适的方法式去除热原。由于热原是有机物，可以将它们氧化为易从水中去除的气体或非挥发固体。高锰酸钾是常用的氧化剂, 小量氢氧化钡可以增加其效率，氢氧化钡可以碱化溶液，使酸生成非挥发性钡盐。这两种试剂加入多次蒸馏的水中，再多次蒸馏，在无菌条件下收。如果很好的生产，用这种方法可以得到高纯，无菌，无热原的水。不管采用哪种方法均要进行热原检查以保证无热原。
除热原工艺举例：烘箱、管道灭菌器、洗瓶、胶塞清洗，例如用氢氧化钠清洗，过滤。
5.验证：
工艺过程中只要存在除热原步骤，不论采用何种除热原的方法均应进行验证。验证的目标是获得热原的3个对数单位下降。
对数下降的计算：
对数下降=未处理样品热原的对数值-处理后样品热原对数值
以干热除热原为例:
小品《碰瓷》
未处理的样品的热原值 = 3,200 EU/ml
处理后样品的热原值 = 0.7 EU/ml
对数下降 = Log (3,200) - Log (0.7)= 3.505 - (-0.155) = 3.7
热原挑战试验
大多数情况下热原挑战试验是验证的必须部分。这需要丞载一定浓度的热原的载体。载体必须能代表工艺要处理的实际的产品。
所用的瓶子：制备> 50,000 EU/ml浓度的热原溶液。每瓶加入100 l热原溶液，空气干燥或冻干。烘试验瓶子，保留未烘的瓶子作对照用。用1ml LAL水溶液复溶，彻底涡旋，将对照样品稀释至1/10,000，测定每个瓶子。
用动力学方法所得的结果如下：
考虑点：
采用干热除热原时要研究工艺的冷点。这些信息可以用以样正瓶了在烘箱或管道灭菌器中的位置。
技术人员要知道可以热处理的物品与只能清洗的产品的明显区别。热处理与时间和温度有关。清洗与工艺较为复杂，因为热原粘附于表面，如橡胶，多孔性聚合物。常见的问题是没有合适的方法来证明小量热原的复活。如 <10-50 EU/ 胶塞。
