第6期王悦颖等：新增耕地土壤的理化特征研究·849·
实现新增耕地的可持续利用[12]。土地复垦项目新增耕地土壤有效磷含量处于中到低水平，这是由于复垦项目客土多以未经种植或施肥改良的生土为主；开发整理项目土壤有效磷含量处于高水平，这是由于该类项目主要整治对象是残次林地和草地，土壤以原有表层土壤为主，表层含磷矿物风化以及植物枯落物返还有益于土壤速效磷的提高[13]。新增耕地土壤速效钾含量与对照耕地存在显著差异，但含量均处于高和中上水平，且两种整治类型项目差异不明显，这可能是由于本区背景土壤钾含量相对较高所致[9,10]。
本研究中土壤容重大小依次为工矿复垦项目、土地开发整理项目、对照耕地，而孔隙度则表现出相反的规律，这主要是由于工矿废弃区土壤在复垦过程中受到大型机械的碾压，土壤颗粒重塑而导致土壤紧实度增加，土壤容重增大，孔隙度变小[14]。土地开发整理项目区在整治过程中受机械碾压的影响较小，较工矿复垦项目区土壤重塑程度低，但由于其较耕作年限较短，土体紧实，容重大于对照耕地。土壤容重与土壤有机质和速效磷存在负相关关系，这与前人研究相同[15-17]。工矿复垦项目区和土地开发整理项目土壤孔隙度小于对照耕地，这可能是由于在整治过程中受到人为扰动和机械碾压，土壤比耕地紧实[18]。此外，土壤孔隙大小与有机质在土壤中的累积量有关[19]，植被及动植物残体是有机质主要来源之一[20]，项目区土壤种植年限短，有机质累积量少，因此土壤毛管孔隙度较低。王修康等[21]在对不同土地利用方式下土壤结构特征及其对土壤持水性的影响的研究中发现，土壤有机质含量与粘粒含量、土壤
颗粒比表面积具有较好的相关关系，说明土壤有机质对土壤粘粒保持与土壤团聚体的形成具有重要作用。在本研究中，工矿复垦土壤和占补平衡土壤田间持水量、毛管含水量显著低于对照耕地，这可能是由于照耕地较土地整治新增耕地土壤有更高有机质含量，因此持水容量较大、保水能力较强。
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山东农业大学学报(自然科学版),2022,53(6):850-857VOL.53NO.62022 Journal of Shandong Agricultural University(Natural Science Edition)doi:10.3969/j.issn.1000-2324.2022.06.006
沉水植物的湿地水质净化效率及其微生物群落结构对水力负荷的响应
王耀辉，曹玉成*，周彦昕
浙江农林大学环境与资源学院，浙江杭州311300
摘要：为探究不同水力负荷下沉水植物对水体污染物的净化效率及其茎叶生物膜微生物群落结构的差异，本文构建人工湿地，通过水泵-阀门-流量计系统精准控制动态水力负荷，研究沉水植物高茎苦草Vallisneria natans L.对模拟污水的净化效率及微生物群落结构差异对不同水力负荷的响应。结果表明，水力负荷可对湿地系统的去污效果产生显著性影响，其中144cm/d效果最佳，该系统氨氮净化效率可达86.9%，TP净化效率可达77.8%，系统出水符合“地表水环境质量标准III类”水体要求。水力负荷可对湿地系统微生物群落结构产生显著性影响（P＜0.05），随水力负荷的增大，沉积物样本中微生物群落相对丰度、多样性以及OTU数量逐渐降低；叶片微生物群落相对丰度、多样性以及OTU数量呈现上升的趋势。与沉积物微生物群落相比，同组内叶片表面微生物群落中变形菌门Proteobacteria、假单胞菌属Pudomonas的总丰度占比显著性提高。
关键词：沉水植物；水质净化；微生物群落结构
中图法分类号:S592文献标识码:A文章编号:1000-2324(2022)06-0850-08
Water Purification Efficiency of Submerged Plants and the Respon between Wetland Microbial Community Structure and Hydraulic Conditions
WANG Yao-hui,CAO Yu-cheng*,ZHOU Yan-xin
College of Environment and Resources/Zhejiang A&F University,Hangzhou311300,China
Abstract:To explore the purification efficiency of submerged plants for water pollutants and the difference of microbial community structure of stem and leaf biofilm under different hydraulic loads,the constructed wetland was constructed,and the dynamic hydraulic load was precily controlled by the pump valve flowmeter system.The purification efficiency of submerged plant Vallisneria natans L. to simulated wage and the respon of microbial community structure difference to different hydraulic loads were studied.The hydraulic load can have a significant impact on the decontamination effect of the wetland system,of which144cm/d is the best.The purification efficiency of ammonia nitrogen and TP of the system can reach86.9%and77.8%,respectively.The effluent of the system meets the requirements of class III water body in the environmental quality standard for surface water.Hydraulic load had a significant effect on the microbial community structure in the wetland system(P<0.05).With the increa of hydraulic load,the relative abundance, diversity and OTU number of microbial communities in diment samples gradually decread;The relative abundance,diversity and OTU number of leaf microbial communities showed an upward trend.Compared with the diment microbial community,the total abundance of Proteobacteria and Pudomonas in the leaf surface microbial community in the same group was significantly incread. Keywords:Submerged plants;water purification;microbial community structure
近年来，随着国家的监管力度和群众对于绿水青山呼声的提高，点源污染逐步得到控制，而以农田退水为代表的农业面源污染正在逐步成为污染的主要贡献者，人畜的饮水安全首当其冲，甚至影响中国经济前景[1-3]。据《第二次全国污染普查公报》（2020）结果显示，农业面源污染对全国地表水体污染负荷中总氮（TN）和总磷（TP）的贡献率分别达到47%和67%，其对素有“鱼米之乡”的太湖流域水体影响更甚，TN、TP的污染贡献率更是高达76%和82%[4,5]。因其溯源性差、隐蔽性强、污染负荷在时空间变化幅度大等深层性特点，导致农业面源污染未能引起公众足够的重视，治理难度也相应陡然上升[6-9]。为此，寻找农业面源污染的科学有效防治手段成为亟待解决的发展要求。
收稿日期:2022-05-07修回日期:2022-06-29
基金项目：浙江省重大科技专项重点社会发展项目(2015C03007)；浙江省重点研发计划项目(2019C03121)；浙江省“三农六方”科技协作项目(CTZB-F170623LWZ-SNY1)
第1作者简介：王耀辉(1996-)，男，研究生在读，从事农业面源污染生态治理研究.E-mail:******************
*通讯作者:Author for correspondence.E-mail:*******************
第6期王耀辉等：沉水植物的湿地水质净化效率及其微生物群落结构对水力负荷的响应·851·
基于生态工程原理的生态沟渠、人工湿地等技术，可因地制宜地依附于农村常见的农田沟渠、泥塘等场所，从源头提高其水质净化等功能[10,11]。因具有建设造价低廉、后续维护简易上手等优势，应用物种共生、物质循环原理，对于农业面源污染处理效果稳定、具有很高的耐冲击负荷，促进废水污染物质良性循环、再生，从而获得污水处理资源化利用的最佳效益，近年来在脱氮除磷工程中获得广泛的研究和应用[12-14]。而合理地设计水力条件，对于人工湿地工程的实际运行和管理都具有重大的现实意义，有利于增强人工湿地的运行稳定性、缩短处理时间、节省工程占地面积[15,16]。
人工湿地中水生植物扮演着极其重要的作用，目前国内外研究以及实际工程应用主要以挺水植物型湿地为主流，沉水植物相关研究存在一定的空白。不同于挺水植物和漂浮植物，沉水植物位于水面下生长，茎叶与水接触最为密切，由其介导形成的微环境结构更为复杂[17,18]。近来年研究发现，沉水植物的茎叶不仅可以直接吸收营养物质，还可以充当载体为微生物、藻类等生物提供附着场所[19]，已有国内研究表明湿地植物在生长的过程中可能会在茎叶表面形成的附植生物膜（Eriphytic biofilm），其富集了水体中的藻类、泥沙、有机质、菌胶团、微生物等物质[20]，这种具有复杂结构的附植生物复合体可以通过吸收、吸附、共沉淀等物理、化学和生物途径截留多种形态的营养物质，对水体中氮磷元素的去除有显著的效果[10]。研究已发现水流和水深等水力条件对其净化效率产生重要影响[21]，但对其影响机理还不明确，特别是对流速影响方面的研究相对较少，水力条件对茎叶微生物影响的相关研究也相对缺乏。
目前国内外多采用静态控制水力停留时间（HRT）的方法以控制水力条件，为更贴切真实治污环境，本研究采用水体动态循环流动，控制湿地水源流速的方法控制水力负荷。研究分析不同水力条件对供试污水氨氮（NH4+-N）、总磷（TP）的去除效果以及茎叶生物膜群落结构的差异，旨在为实际治理应用提供理论指导。
1材料与方法
1.1人工湿地系统构建
采集太湖流域沉积物作为植物培养底泥，模拟人工湿地微生物环境；选取高茎苦草(Vallisneria natans L.)作为湿地供试植物，其为长江中下游流域常见的优势水生植物，为多年生沉水草本，多见于河流、溪沟、池塘、湖泊等水域环境中，有匍匐茎，根系较为发达。试验在浙江农林大学平山新村实验基地大棚内进行，依据《人工湿地污水处理技术导则》(RSIN—TG006—2009)要求，构建19组模拟人工湿地系统，其中包含4组规格为60cm（L）×30cm（W）×70cm（H）的三格式静态批式湿地系统以及15组三格式动态批式湿地系统（图1），每个系统内仅栽种单种植物，种植密度为30~35株/m3，水泵将蓄水箱中的污水经由流量控制阀泵入湿地系统进水口，污水经过进水区、植物种植区，最后从湿地系统出水区上方的出水口自流回系统下方的蓄水箱完成循环。
范仲淹的故事
图1动态湿地系统示意图
Fig.1Schematic diagram of dynamic wetland system
注：1.基质铺设为下层铺设厚度为6cm的太湖底泥，上层铺设厚度为8cm粒径为6~8mm水处理专用石英砂；2.进水口、出水口与植物种植区之间的挡板在20-50cm高度处均匀打孔，孔径为7mm。
Note:1.The substrate is laid with6cm thick Taihu Lake Sediment in the lower layer and8cm thick quartz sand with particle size of6~8mm for water treatment in the upper layer;2.The baffle between the water inlet,water outlet and the plant planting area shall be drilled evenly at the height of20-50cm,and the hole diameter is7mm.
·852·山东农业大学学报(自然科学版)第53卷
1.2湿地系统供试水质
系统进水模拟生活污水各项指标，主要成分包括分析纯(NH4)2SO4、NaH2PO4等，各项水质指标见表1。
表1湿地系统供试水质指标
Table1Water quality indexes of wetland system
指标Index
氨氮/mg/L
Ammonia nitrogen(NH4+-N)
总磷/mg/L
Total phosphorus(TP)
低负荷水样 1.83~1.980.34~0.39
平均值 1.950.37
1.3试验处理
试验进行时间为2021年6-11月，试验开始时各处理组中移植长度为10cm的高茎苦草萌发苗。水体流态分为：静态批式、低流速循环批式（进水速度恒定为35L/min）、高流速循环批式（进水速度恒定为70L/min）；每7d换水1次（整个试验周期内供试水质指标尽量保证相同），换水前后各取一次水样，均采集各装置进水区、种植区、出水区和储水箱水样组成混合样，水质分析指标包括氨氮浓度和总磷浓度，试验结束时刻立马无菌采集各装置内沉积物样本以及沉水植物植株，将沉积物样本编号为：SA（静态组）、SB（低流速组）、SC（高流速组）并保存于-80℃冰箱备用；植株叶片使用无菌PBS洗脱液进行生物膜洗脱处理，经抽滤后得到沉水植物叶片附植生物膜样本，并编号为：BA（静态组）、BB（低流速组）、BC（高流速组），洗脱液保存在4℃冰箱备用。采用高通量测序法测定分析湿地系统内微生物的各项生物指标。各试验组运行参数如表2。
表2各试验组运行参数
Table2Operating parameters of each test group
项目Item
水体流态
游香港
Water fluidization
副食品批发利润水力负荷/cm·d-1
Water load
云南大学排名处理组A静态批式0
处理组B低流速循环批式144
处理组C高流速循环批式288
1.4微生物高通量测序及群落结构分析方法
本试验采用Illumina平台对群落DNA片段进行双端（Paired-end）测序，采用DADA2方法进行去引物、质量过滤、去噪等步骤，再对核酸序列中的插入和缺失错误进行纠正后得到ASV特征序列，对其长度分布进行统计、物种分类学注释，产生ASV/OTU丰度表。
采用QIIME（2019.4）、R语言等软件，使用未抽平的ASV/OTU表，设置最小抽平深度为10，设置全体样本中最低测序深度样本序列量的95%，在这两种深度之间均匀选取10个深度值，每个深度值抽平10次，选取最大抽平深度时的得分平均值作为Alpha多样性指数；使用抽平后的ASV/OTU 表，经调用命令计算Bray-Curtis、Jaccard等距离矩阵并做PCoA分析，绘制成二维散点图，实现相应区域的可视化；利用Perl脚本对抽平后的ASV/OTU表格进行统计样本的域、门、纲等七个分类水平各自含有的单元数目。
1.5数据处理与分析
采用Excel和SPSS进行数据统计与分析(显著水平设为P＜0.05)，采用Origin9.1软件进行图形绘制，包括比较高茎苦草在不同水力负荷下对污水氨氮、TP的去除率及差异等。
2结果与分析
2.1不同水力负荷对氨氮、总磷去除能力的影响
已有研究表明人工湿地去除氨氮、总磷的能力与水力负荷、基质类型、植物种类、温度等因素密切相关，其中水力负荷是重要影响因素[22]。人工湿地水力负荷的常用计算方法为以水量除以表面积，实际为表面负荷；本文采用水量除以过流断面面积，更能真实的反应水力负荷的真实含义，也
第6期王耀辉等：沉水植物的湿地水质净化效率及其微生物群落结构对水力负荷的响应·853·更切合人工湿地的特点，折合低流速循环批式水力负荷为144cm/d ，高流速循环批式水力负荷为288cm/d 。通过处理组A （静态批式组）、处理组B （低水力负荷组）、以及处理组C （高水力负荷组）交叉对比，分析高茎苦草在不同水力负荷下对各污染物的去除效果。
2.1.1水力负荷对氨氮去除效果的影响由图2（a ）可见，在所有换水周期内，湿地系统对氨氮的去除率随换水周期的增加呈现先升高后降低的趋势；第1~2次换水周期，苦草处于幼苗期，茎叶长度为7~15cm ，叶片呈嫩绿色，表面无明显附植生物膜，第3~4次换水周期，苦草由幼苗期生长到繁盛期，茎叶长度为30~50cm ，叶片呈翠绿色，其表面的附植生物膜也随之壮大，第4次换水周期苦草在静态、低水力负荷、高水力负荷下对氨氮的去除效率均达到峰值；第5~6次换水周期，苦草由繁盛期转为初始凋败期，叶片末梢呈黄绿色，叶片变薄且有半消解状态的絮状，植物对湿地系统的供氧能力下降，叶片附植生物膜生理活性降低，对氨氮的去除率有所下降。
采用同水力负荷下六个周期氨氮去除率和氨氮去除负荷两个指标的平均值表征所构建的人工湿地对污
水的脱氮能力。由图2（b ）可见，随着水力负荷的增加，湿地系统对氨氮的去除率和去除负荷均呈现先升高后降低的趋势，结合显著性分析结果（P ＜0.05）可知，水力条件的改变导致各处理组的氨氮去除率之间存在显著差异。
图2水力负荷对氨氮去除效果的影响
Fig.2Effect of hydraulic load on ammonium nitrogen removal
2.1.2水力负荷对TP 去除效果的影响由图3（a ）可见，随换水周期的增加，植物的生长状况同上；第1~2次换水周期，各试验组TP 去除率即出现峰值，在随后的第3~6次换水周期内，各试验组TP 去除率均呈现不同程度的下降趋势。
采用同水力负荷下六个周期TP 的去除率和去除负荷两个指标的平均值表征所构建的人工湿地对污水的脱氮能力。由图3（b ）可见，随着水力负荷的增加，湿地系统对TP 的去除率和去除负荷均呈现小幅度的升高后迅速降低的趋势，同周期内湿地系统对TP 去除率由大到小为：低水力负荷组＞静态批式组＞高水力负荷组。结合显著性分析结果（P ＜0.05）可知，各装置TP 净化能力对水力条件改变的响应为：静态试验组和低流速试验组之间不存在显著差异，高流速试验组与前两组间存在显著差异，TP 去除负荷这一指标尤为明显。
图3水力负荷对TP 去除效率的影响
Fig.3Effect of hydraulic load on TP removal efficiency a b b a
