质粒的复制
严紧型和松弛型复制
质粒拷贝数是指在正常生长条件下，每个细菌细胞或每条染色体所对应的平均质粒数。在质粒复制子的调控下，质粒拷贝数可随细菌培养条件的变化在一个较窄的范围内波动。生长条件恒定时，质粒增殖的速度与宿主细胞增殖的速度完全一致，拷贝数保持不变。
无论是质粒，还是其复制子，均能通过合理分配提供影响质粒DNA合成起始频率的分子而维持其自身的复制与宿主增殖速率的协调。在携带pMBl/colEl 复制子的质粒中，这种正向调节分子是一种RNA，被称为RNAⅡ，它被用作引发DNA 前导链的起始合成。但是，其他复制子(如pSC101)的调节分子则是一种顺式作用蛋白(RepA )，它对复制的起始具有正向作用，而对其自身基因的转录具有负调控作用(Linden et al.1985；综述见Nordstrom 1990; Nordstrom and Wagner 1994; Helinski et al. 1996)。在任何情况下，正向调控的RNA和蛋白质分子的合成和活性都受到辅助性的反式作用产物的调节，后者的浓度随质粒拷贝数或宿主菌的生理状态的变化而变化。
以RNA分子为其正向调控分子的质粒通常具有高拷贝数，其复制不需任何质粒编码的蛋白质。相反，它们完全依赖于宿主提供的寿命较长的酶和蛋白质，包括分子伴侣、DNA聚合酶I和Ⅲ, DNA依赖的RNA聚合酶、核糖核酸酶H (RNa H), DNA促旋酶和拓扑异构酶I(综述见Helinski et aI. 1996)。这些质粒以所
谓的“松弛”方式进行复制，即使在蛋白质的合成因氨基酸饥饿(Bazaral and elinski 1968)或添加抗生素如氯霉素(CIewell and Helinski 1969)而受到抑制时(参见信息栏“氯霉素”)，质粒复制仍不停止。由于蛋白质的合成为宿主DNA 每轮合成的起始所必需，而非质粒复制所必需，因此经氯霉素处理的细胞中质粒DNA的浓度相对于染色体bNA的量会有所增加(Clewell 1972 )。经过几个小时的扩增，细胞中可能积累数千拷贝的松弛型质粒，最后质粒DNA可占细胞DNA 总量的50%甚至更多。相反地，像pSC101这类质粒的复制需伴随RepA蛋白的合成，因此一旦细胞蛋自质合成受阻，其拷贝数或产量均不能增加。这样的质粒被称为在“严紧”控制下复制的质粒。
colE1复制起点上DNA合成的起始以RNAⅡ为引物
起始发生于含有复制所必需的所有顺式作用元件的600个核苷酸的区段。DNA 前导链的合成以RNAⅡ(图1-1)为引物(综述见Eguchi et al,1991).
RNAⅡ前体的合成起始于其复制起点上游550bp处的启动子区，继而穿过复制起点，终止于下游大约150个核苷酸附近的一个位点。此约750个核苷酸的起始转录物的5'端折叠成复杂的二级结构，从而使RNA且产生一个富G环，后者与位于模板链复制起点上游20个核苷酸处的质粒DNA富C区正好匹配。随后，该RNAn转录产物由RNaH加工为成熟引物，其切割位点位于复制起点内5个A 序列中。所得的555个核苷酸的成熟RNA II被DNA聚合酶I用作引物启动前导链的合成(综述及参考文献见Kues and S
tahi 1989; Cesareni et al,1991; HelinslCi et al. 1996)。DNA-RNA稳定杂交体的延伸，暴露了DNA互补链上某些位点，后随链的不连续合成即在此处起始。因为后随链的合成在复制起点的上游约ZO 个核苷酸处被RNA II的非杂交片段封闭，因此在携带pMB1/colE1复制
子的质粒中，复制过程按凯恩斯(Cairns )结构(或称θ结构)无定向地进行。RNA工是复制的负调节物
colE1复制子不能影响质粒复制所必需的宿主酶的活性，因此，一旦DNA合成启动后，便不能改变其速度或进程。故而拷贝数的控制必须在DNA复制启动时或启动前进行。质粒DNA的合成依赖于复制起点处稳定的DNA-RNA II杂交体的形成。正常情况下，复制的起始是由正确折叠与不当折叠的RNA 1I间相互转化的平衡来控制的，前者可形成稳定的杂交体，后者则不能。
这一平衡的改变主要由RNAⅠ来控制，RNAⅠ是由RNAⅡ基因的反义链编码的108个碱基小分子转录物。它折叠成可与新生RNA II前体结合的三叶草结构，从而阻止后者折叠成形成稳定杂交体所必需的二级结构(LaCatena and Cesareni 1981)。青椒蛋炒饭>社区个人述职报告
图1-1 colE1复制子中DNA的合成:RNAⅠ和RNAⅢ的相互作用
(A)colE1 复制子的遗传学图潜及其此区域的转录模式。(B) RNAⅡ充当colE1复制子中DNA 合成的引物。合成RNAⅡ的过程中，新生RNA分子的5'区折叠成一种特定构型，从而使不断延伸的3'端与复制起点上的DNA模板形成稳定的DNA-RNA杂交体。RNA H将RNA的3’区加工成DNA聚合酶I合成前导链的引物。(C)与Rom/Rop二聚体蛋白结合，使RNA I与RNAll 形成稳定的“亲吻”复合物。(D) RNAⅠ和RNAⅢ之间“亲吻复合物”的放大。由RNAI和RNAⅡ形成稳定的复合物通过抑制ANAB与DNA稳定杂交体的形成而阻止DNA合成。
RNAI与RNAⅡ相互作用的机制曾由Tomizawa及其同事做过详细阐述(Tarnizawa 1990a)。图中显示RNAⅠ与RNAⅡ短寿命折叠中间体间的一种动力学相互作用。当新生RNAⅡ转录物的长度在80~360个核苷酸之间时，其折叠特别容易受到RNAⅠ的干扰。结合首次发生于这两个RNA分子的茎环结构，导致RNA II 的5'区与全程RNAⅠ形成一段双链RNA。因此. RNAⅠ作为质粒DNA合成起始的负调节物控制质粒拷贝数。
支教工作总结
pUC质位家族的拷贝数远远高于携带pMB1或colE1复制子的其他质粒的拷
贝数。这是由于pUc质粒带有一个点突变，可依温度不同改变正调节分子(RNAⅡ)的二级结构。在37℃或42℃下，RNAⅡ似乎折叠成抗RNAⅠ抑制的构型。于是DNA合成的起始加强、结果拷贝数特别高。当
细苗生长于30℃时，pUC质粒的拷贝数恢复正常(Lin-Chap et al.1992 )。
帽子折法
解释维持质粒拷贝数的最简单假说是胞质内RNAⅠ的稳态浓度是由基因剂
量决定的(Tomizawa 1987;Chiang and Brerner 1991)。如果质粒的拷贝数高出正常值，RNAⅠ的浓度便上升，质粒DNA的复制受抑制。不过只有RNA i的半衰期较短(Pritehard 1984)和RNAⅠ的降解速率与细菌的生长速率成比例时，质粒拷贝数与抑制剂浓度波动之间的这种关联才能发生。在细胞的正常生长条件下，这两种情况似乎都会发生，此时RNA工的半衰期为1~2 min。动力学计算显示这一时期足够短，以至该分子可以作为质粒拷贝数的实时监测器(Brendel and Perelsan 1993)。
RNAⅠ的降解过程分为两个阶段。首先，由RNaE将其5'端的5个核苷酸切除，所形成的截短分子仍能与RNAⅡ结合，但易被一种核糖核酸酶降解，该酶的活性对生长速度敏感(Lin-Chan and Cohen 1991)。此种调节提供了维持恒定质粒拷贝数的机制，即使在细胞呈间歇式生长时亦不例外。
ROM/ROP蛋白对RNAⅠ负调节活性的调控
由质粒编码的一种被称为ROM(RNAⅠ modulator)或ROP(repressor of primer)的蛋白质可提高RNAⅠ与RNAⅡ结合的效率。ROM蛋白通过促进RNAⅠ和RNAⅡ杂交体的形成，增强RNAⅠ的负调节作用。因此，rom/rop基因缺失至少可使colE1质粒拷贝数提高两个数量级(Twigg and Sherratt 1980)。例如，rom /rop基因
梁皇宝忏>水杨酸类
电脑风扇异响的缺失可使较早期组建的载体pBR322在每个细菌细胞中的质粒拷贝数从15~20个增至500个以上，在ram/rop基因中插入一段外源 DNA片段，则可导致致死性的大量质粒DNA复制(Giza and Huang 1989)。
ROM 是含有63个氨基酸的多肽的同型二聚体，它由位于colE1复制起点下游400个核苷酸处的一个基因所编码(Twigg and Sherratt 1980;Tomizawa and Som 1984)。该二聚体每个亚单位含有由一个转角连接的两个α螺旋，因而此二聚体是由4个α螺旋组成的呈双重对称的紧密束状结构(Banner et al. 1987)。ROM蛋白一与RNAⅠ和RNAⅡ具有相似的亲和力太空旅行
(Helmer-Citterich et al.1988).它促使这两种RNA分子的互补结合物由不稳定的中间体变为更稳定的结构(Lacatena et a1. 1984;Tomizawa and Som 1984;Tomizawa 1990b)。很可能ROM蛋白两个亚单位中的任何一个都能识别RNAI和RNAⅡ中的序列和结构元件。ROM蛋白与RNA相互作用时形成的茎相结合，从而稳定“亲吻”复合物(Tamizawa 1985)并起始RNAⅠ-RNAⅡ完美杂交体的形成( Eguchi and Tomizawa 1990)。
