基金项目：国家重点研发计划（2017YFD0500301）；上海市卫生健康委员会卫生行业临床研究专项（20194Y0169）作者简介：郁晨蕾，女，1988年生，学士，主管技师，主要从事结核病耐药检测研究。通信作者：张阳奕，E-mail ：。
细菌超声分散计数仪在结核分枝杆菌最小抑菌浓度检测中的
应用
郁晨蕾， 江 渊， 李 静， 王莉莉， 陈 炜， 沈旭晖， 张阳奕（上海市疾病预防控制中心结核病检测实验室，上海 200336）
摘要：目的 评估细菌超声分散计数仪在结核分枝杆菌（MTB ）最小抑菌浓度（MIC ）检测中的应用价值。方法 应用分散仪法和玻璃珠振荡研磨法2种细菌分散定量方法分别制备MTB 标准菌株H37Rv （ATCC 27294）和28株MTB 临床分离株菌悬液，接种于TREK Sensititre MYCOTB 药敏板（简称MYCOTB ），进行体外药物敏感性试验。通过肉眼观察、抗酸染色镜检、药敏板中菌落形态和药物敏感性试验结果，评估细菌超声分散计数仪在MIC 测定中的应用价值。结果 通过肉眼观察和抗酸染色镜检，发现细菌超声分散计数仪制备的菌悬液分散效果更好。药物敏感性试验结果显示，2种方法符合率为100%。结论 细菌超声分散计数仪可以提升制备MTB 菌悬液的自动化程度，尤其在药物敏感性试验类定量试验中，可减少人为因素引起的定量误差，有利于检测的标准化和重现性。
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关键词：结核分枝杆菌；超声分散计数仪；最小抑菌浓度；体外药物敏感性试验
Application of BAC spreader for minimum inhibitory concentration determination in Mycobacterium tuberculosis YU Chenlei ，JIANG Yuan ，LI Jing ，WANG Lili ，CHEN Wei ，SHEN Xuhui ，ZHANG Yangyi.（Tuberculosis Reference Laboratory ，Shanghai Municipal Center for Dia Control and Prevention ，Shanghai 200336，China ）
Abstract ：Objective To evaluate BAC spreader for minimum inhibitory concentration （MIC ） determination in Mycobacterium tuberculosis （MTB ）. Methods BAC spreader and glass bead grinding were ud respectively to prepare bacterial suspensions of MTB ATCC 27294 standard strain H37Rv and 28 clinical MTB strains ，and the bacterial suspensions were inoculated into TREK Sensititre MYCOTB well for drug susceptibility test. The performance of BAC spreader on MTB MIC was assd by visual obrvation ，acid-fast staining ，colonial morphology in MYCOTB well and drug susceptibility test results. The role of BAC spreader for MIC determination in MTB was evaluated. Results The results of visual obrvation and acid-fast staining showed that the bacterial suspensions of BAC spreader were disperd. The drug susceptibility test results showed that the consistency rate of the 2 methods was 100%. Conclusions The BAC spreader can improve the automation of MTB bacterial suspension preparation ，particular in quantitative test as
MIC drug susceptibility test ，reducing the quantitative error caud by human factors ，which is beneficial to the determination standardization and reproducibility.
Key words ：Mycobacterium tuberculosis ；BAC spreader ；Minimum inhibitory concentration ；Drug susceptibility test民主选举
文章编号：1673-8640（2021）06-0650-06 中图分类号：R378.91 文献标志码：A DOI ：10.3969/j.issn.1673-8640.2021.06.016
耐药结核病（resistant tuberculosis ，R-TB ）的防治是我国结核病防治工作中的难题之一，随着GeneXpert MTB/RIF 检测系统在疑似肺结核病患者检测中的广泛应用，越来越多的利福平
耐药结核病（rifampicin-resistant tuberculosis ，RR-TB ）患者被确诊[1]。一线、二线抗结核药物的体外药物敏感性试验在个体患者的治疗和人群结核病的防控中都起着重要作用[2]。TREK
的0.9%NaCl 溶液）、0.5麦氏单位标准管、0.9%NaCl 溶液。1.3 制备菌悬液
1.3.1 玻璃珠震荡法 采用接种环挑取改良罗氏培养基（瑞士罗氏公司）斜面适量菌落，放入振荡管中，在漩涡混合器中振荡30 s ，在室温条件下静置15 min 后，放入手工比浊仪器中，滴加0.9%NaCl 溶液混合及定量，调整菌悬液浓度至0.5麦氏浊度。
1.3.2 分散仪法 采用接种环挑取改良罗氏培养基斜面适量菌落，放入含2 mL 无菌0.9%NaCl 溶液的超声分散专用试管中，将试管放入1100分散仪，超声分散30 s （超声分散5 s ，暂停5 s ，实际对细菌超声分散15 s ）。按照仪器显示屏上显示的数字，加入相应体积的0.9%NaCl 溶液，调整菌悬液浓度至0.5麦氏浊度。1.4 药物敏感性试验
取100 μL 制备好的菌悬液，加入11 mL Middlebrook 7H9培养基（美国BD 公司）中混匀，采用AIM-自动菌液接种系统分装至96孔MYCOTB 中，每孔100 μL 。完成后将MYCOTB 贴上封膜，放置在37 ℃温箱中孵育。培养10 d 后，采用Vizion-自动微生物药敏分析系统判读结果，并拍照保存。每个药敏板都由双人判读，以第1个人的判读结果为标准，第2个人的判读结果用于评估2个人判读结果的一致性。1.5 质量控制
每批药物敏感性试验均以MTB 标准菌株H37Rv （ATCC 27294）作为质控菌株。玻璃珠震荡研磨法中，每批试验前均用配套的0.5麦氏单位标准管对所用的比浊仪进行校准；分散仪法中所用的1100分散仪使用前均进行浊度 校正。
1.6 统计学方法
采用SPSS15.0软件和Excel 2007软件进行数理整理和分析。对2种方法制备菌悬液的MIC 药物敏感性试验结果进行一致性检测（Kappa 检验），以Kappa 值≥0.75为2种方法一致性较好。2 结果2.1 分散
效果
应用玻璃珠震荡研磨法和分散仪法制备28株MTB 临床菌株和MTB 标准菌株H37Rv （ATCC
Sensititre MYCOTB 药敏板（简称MYCOTB ，美国赛默飞世尔公司）可测定12种一线、二线抗结核药物的最小抑菌浓度（minimum inhibitory concentration ，MIC ），相较于传统固体比例法药物敏感性试验，有着耗时少、单次可检测多种药物、药物敏感性试验结果更精细等优点
[3-5]
。
因MYCOTB 在需要判读多个孔内细菌的生长情况时对细菌的接种量有着极其严格的要求，使其在临床应用上存在双人判读结果不一致和重复试验结果不一致的问题。
MYCOTB 操作手册建议采用玻璃珠振荡研磨法对菌株进行研磨分散，用配套浊度仪定量，菌悬液需要多次稀释定量以达到目标浓度。接种于药敏板的菌液终浓度受人为因素影响较大，多次稀释容易产生大量气溶胶，存在实验室生物安全隐患。细菌超声分散计数仪利用超声波分散原理，可以实现细菌分散与浊度检测的同步，快速、简单、安全[6]。本研究将细菌超声分散计数仪应用于结核分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis ，MTB ）药物敏感性试验，对比2种菌悬液制备方法的效果，通过肉
眼观察、抗酸染色镜检、药敏板中菌落形态和药物敏感性试验结果，评估细菌超声分散计数仪在MTB MIC 检测中的应用价值。1 材料和方法1.1 研究对象
以上海市疾病预防控制中心结核病检测实验室收集保藏的23株耐多药MTB 临床菌株（编号1～23），5株全敏感MTB 临床菌株（编号24～28）为研究对象，MTB 标准菌株H37Rv （ATCC 27294）由中国疾病预防控制中心结核病预防控制中心结核病参比实验室提供。1.2 主要仪器与试剂
BACspreader 1100细菌超声分散计数仪（简称1100分散仪，广东体必康生物科技有限公司）；Sensititre 微生物鉴定药敏分析系统[赛默飞世尔科技（中国）有限公司]，包括Vortex-Genie2多功能漩涡混合器（Cole-Parmer ）、手工比浊仪、AIM-自动菌液接种系统、Vizion-自动微生物药敏分析系统、MTB 药敏板（MYCOTB ，含12种不同浓度抗结核药物）、振荡管（含玻璃珠和含0.5% Tween-80
27294）0.5麦氏浊度的菌悬液。肉眼观察结果显示，分散仪法制备的菌悬液比玻璃珠振荡研磨法更均匀，无明显大的菌落颗粒（图1）。取2种方法制备的0.5麦氏浊度的菌悬液各1滴，紫外照射固定2 h 后抗酸染色，显微镜下观察，镜下可见分散仪法制备的菌悬液比玻璃珠振荡研磨法分散更均匀，细菌成团较少（图2）。2.2 药敏板中菌落形态
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根据MYCOTB 说明书要求，经过10 d 37℃温箱培养后，将MYCOTB 放入Vizion-自动微生物药敏分析
系统进行结果判读。结果显示，相较于玻璃珠振荡研磨法，分散仪法制备的菌
注：1号管为玻璃珠振荡研磨法制备的菌悬液；2号管为分散仪法制备的菌悬液。
图1 2
种方法制备的菌悬液分散效果比较
注：（a ）玻璃珠振荡研磨法制备的菌悬液；（b ）分散仪法制备的菌悬液。
图2 2种方法制备的菌悬液抗酸染色显微镜下结果（×1 000
）
（a ）
（b ）
惬意怎么读音注：（a ）玻璃珠振荡研磨法制备的菌悬液菌落形态；（b ）分散仪法制备的菌悬液菌落形态。
图3 2种方法制备的菌悬液在MYCOTB
中的菌落形态
（a ）（b ）
2.3 药物敏感性试验结果
28株MTB 临床菌株和MTB 标准菌株H37Rv （ATCC 27294）的MIC 值结果和药物敏感性试验比对结果显示，2种不同前处理方法制备的菌悬液对12种一线和二线抗结核药物（链霉素、异烟肼、乙胺丁醇、利福平、氧氟沙星、莫西沙星、阿米卡星、利福布汀、对氨基水杨
酸、乙硫异烟胺、环丝氨酸和卡那霉素）的符合率均为100%，Kappa 值均为1.00，仅有8株菌株的乙胺丁醇、2株菌株的环丝氨酸和3株菌株的卡那霉素的MIC 值存在1个梯度的量化误差。由于这些量化误差均不处于MTB 对各药物的耐药浓度附近，故不影响结果的判读。见表1、 表2。
悬液细菌生长活力更好，孔中细菌生长面积更大，结果更易判读（图3）。
表1 玻璃珠振荡法和分散仪法制备菌悬液进行药物敏感性试验的MIC值μg/mL
醯醢抗菌药物H37Rv1号2号3号4号5号6号7号a b a b a b a b a b a b a b a b
阿米卡星0.50.50.120.120.120.120.120.120.50.50.120.120.250.250.250.25环丝氨酸161644161616161616161616161616乙胺丁醇1124882288881224乙硫异烟胺0.60.60.30.3550.60.6
1.2 1.20.60.60.60.62020异烟肼0.060.06220.50.52244221144卡那霉素 2.5 2.50.60.60.60.60.60.6 1.2 1.20.60.6 1.2 1.2 1.2 1.2莫西沙星0.250.250.060.06220.120.12110.120.120.060.0644氧氟沙星1122880.50.5440.250.250.250.2511对氨基水杨酸0.50.50.50.50.50.50.50.50.50.50.50.50.50.51616利福布汀0.120.1211111111111144利福平0.120.121616161616161616161616161616链霉素0.50.532324432323232323232321616
抗菌药物
8号9号10号11号12号13号14号a b a b a b a b a b a b a b
阿米卡星0.120.120.120.120.120.120.250.250.250.25220.250.25环丝氨酸441616161648161664646464乙胺丁醇12442212888822乙硫异烟胺10100.60.6 1.2 1.2 2.5 2.5552020 2.5 2.5异烟肼44222222444444卡那霉素0.60.60.60.60.60.60.60.6 2.5 2.52020 1.2 1.2莫西沙星220.120.120.120.120.060.0622880.250.25氧氟沙星0.250.250.50.50.50.50.250.258816160.50.5对氨基水杨酸16160.50.50.50.5110.50.564640.50.5利福布汀2211442222161688利福平1616161616161616161616161616链霉素1616323232323232323232320.250.25
抗菌药物
15号16号17号18号19号20号21号a b a b a b a b a b a b a b
阿米卡星0.250.250.120.120.250.250.250.250.120.120.250.250.250.25环丝氨酸881616881616161616161616乙胺丁醇448881644882222乙硫异烟胺0.60.6 2.5 2.54040 2.5 2.5 1.2 1.20.60.60.60.6异烟肼22222222222222卡那霉素550.60.6 1.2 1.20.60.6 1.2 1.2 1.2 1.2 1.2 1.2莫西沙星0.120.121144440.120.120.50.50.50.5氧氟沙星0.250.25228888111111对氨基水杨酸0.50.50.50.5440.50.50.50.50.50.50.50.5利福布汀11111111111111利福平1616161616161616161616161616链霉素0.50.5111122221111
3 讨论
菌悬液的制备和定量是MTB 药物敏感性试验，尤其在MIC 药物敏感性试验这类定量试验中的关键操作[6]。目前，我国大多数结核病实验室主要采用研磨棒研磨和玻璃珠振荡的方法进行菌落分散，通过标准麦氏比浊管或比浊仪进行定量，多次加入含0.5%Tween-80的0.9%NaCl 溶液进行逐步稀释比对，最终获得目标浓度的菌悬液。上述2种方法在研磨、多次稀释混合中均会产生大量气溶胶，存在生物安全隐患。同时，由于是手工操作，细菌悬浮液的均匀度受细菌研磨时间等人为因素影响，样本个体之间存在很大差异，这也是影响药物敏感性试验结果的最常见的人为因素[7]。细菌超声分散计数仪通过超声波在液体中的空化作用来分散菌落，分散、浊度检测和稀释体积计算的整个过程在一个封闭的空间中完成[8]，不需要移动液体，减少了污染，最大程度地确保了生物安全性，并大大提高了效率。
本研究通过肉眼观察、抗酸染色镜检、药敏板中菌落生长形态和药物敏感性试验结果比对，对玻璃珠振荡研磨法和分散仪法制备的菌悬液的药物敏感性试验结果进行评估。结果显示，相较于玻璃珠振荡研磨法，分散仪法对MTB 分散得更均匀，无明显大的菌落颗粒，且抗酸染色镜检未见明显菌体聚集现象。有多项研究将手工研磨处理的菌悬液和分散仪处理的菌悬液进行比较，结果均显示分散仪对微生物菌落的分散效果更好[6-8]。本研究比较了玻璃珠振荡研磨法和分散仪法对菌落的分散效果，结果仍是分散仪的分散效果更均匀，说明应用超声波在液体中的空化作用来分散菌株的效果要远优于手工和机械物理研磨。冯通明等[6]的研究结果也证实了只要分散时间不超过120 s ，超声并不会影响菌体的生长活性。
本研究中，将采用2种方法制备的菌悬液接种于MYCOTB 37 ℃培养10 d 后，接种分散仪法制备的菌悬液的药敏板孔内菌落面积更
表2 2种方法制备的菌悬液药物敏感性试验结果比较 株
玻璃珠振荡研磨法分散仪法
苹果手机怎么设置壁纸阿米卡星环丝氨酸乙胺丁醇乙硫异烟胺异烟肼卡那霉素莫西沙星氧氟沙星对氨基水杨酸利福布汀利福平链霉素敏感耐药敏感耐药敏感耐药敏感耐药敏感耐药敏感耐药敏感耐药敏感耐药敏感耐药敏感耐药敏感耐药敏感耐药敏感2802601902305 02601902102305 05 014 0耐药
2
9
5
23
2
9
7
5
23
23
电话怎么拉黑014
续表1
抗菌药物22号23号
24号
25号
26号
27号
28号
a b a b a b a b a b a b a b 阿米卡星0.120.12220.250.250.250.250.250.250.250.250.250.25环丝氨酸816161616161616161616161616乙胺丁醇128161122222211乙硫异烟胺1010 2.5 2.50.60.6 1.2 1.20.60.60.30.30.30.3异烟肼11220.060.060.060.060.030.030.030.030.030.03卡那霉素 1.2 1.21020 1.2 2.5 2.5 1.2 2.5 2.5 1.2 1.2 1.2 1.2莫西沙星44220.250.250.250.250.250.250.50.50.250.25氧氟沙星88221111111111对氨基水杨酸16160.50.50.50.50.50.50.50.50.50.50.50.5利福布汀22110.120.120.120.120.120.120.120.120.120.12利福平2216160.120.120.120.120.120.120.120.120.120.12链霉素
无线耳机使用方法0.25
0.25
3232
0.250.25
0.250.25
0.250.25
0.250.25
0.250.25
注：a 表示玻璃珠震荡法；b 表示分散仪法。
