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第一章嘉兴好玩的地方 细胞培养的基本知识
第一节 前 言
细胞培养(cell culture)是指细胞的离体培养，包括单个细胞的培养。具体说来，是指在无菌条件下，把动物或植物的细胞从有机体中分离出来，置于培养器皿中，并在一个合适的环境中，给以营养物质，使之继续生存和生长的方法。广义上的细胞培养包括器官培养(organ culture)、组织培养(tissue culture)和细胞培养(cell culture)。但因从组织块生长出来的仍然是细胞，细胞在生长的同时发生移动，使得培养中的组织难以长时间保持其原有的结构，因此三者并无严格的区别。一般所说的细胞培养，即包括器官培养、组织培养和细胞培养三层含义。
细胞培养的发展历史已近百年。最初的细胞培养是胚胎学和微生物学的引申，建立于无菌原则的基础上，用天然体液(如胎汁、血浆)来维持从整体切下的组织块，以对细胞进行形态和功能的观察。Harrison和Careel(1907, 1910)首创了盖片覆盖表玻璃的悬滴培养法，建立了离体培养组织和细胞的基本模式。后来许多学者在培养容器、培养液和培养操作技术方面加以改进和革新：在卡氏瓶的启示下，设计出多种类型的培养瓶；培养基由天然动物血浆改
进为合成培养基；促细胞生长物质从胎汁改为动物血清；Dulbecco(1957)等采用胰蛋白酶消化处理组织，获得了单层培养物，对细胞培养的发展起了积极的推动作用，单层培养遂成为细胞培养普遍采用的技术。采用单层培养法建立了各种细胞系和细胞株，现在全世界储存的细胞株约有万种以上。Sanford(1948)创立了单细胞分离培养法，应用这一技术可建立遗传性状相同的克隆细胞株(clone strain)。今天的组织培养已可把多细胞机体中各种完整的细胞和组织从错综复杂的体内影响和相互关系中分离出来，置于离体因素的直接作用下，长时间直接观察活细胞的形态结构和生命活动过程，并可利用不同的技术方法，如相差显微镜、荧光显微镜、电子显微镜、同位素标记以及缩时显微电影等观察、记录和研究细胞。体外培养使体内非常复杂和相互依赖的关系简化，能对细胞施加物理、化学和生物等外来实验条件，便于进行单一因素对细胞影响的研究和对机理的分析，提供与体内生物性状相似的对比物，综合分析体内外实验所得的结果，更好地得到体内连续实验很难得到的结论，同时也更为经济实用。现在细胞培养不仅是细胞生物学必需的技术，而且也是分子生物学、肿瘤学、遗传学和免疫学等学科必要的方法，同时也日益成为生物工程的生产手段，如大规模的中空纤维培养法，能用于工业化生产多种生物制品如激素、生长因子和单克隆抗体等。
细胞培养的优点就在于：(1) 便于应用各种物理、化学和生物等外界因素探索和揭示细胞生命活动的规律；(2) 便于应用各种不同的技术方法研究和观察细胞结构和功能的变化；(3) 可长期研究和观察细胞遗传行为的改变；(4) 可提供大量生物性状相同的细胞作为研究对象，耗资少，比较经济；(5) 可为动、植物基因组的长期保存提供一种行之有效的手段。
尽管细胞培养具有很多优点，但也存在一定的不足。其最根本的问题是尽管培养技术不断发展，并努力创造条件以模仿动物体内的状态，但体外培养的组织或细胞与体内相比仍然存在着较大的差异，特别是细胞分化的问题。可以说，任何组织或细胞经过体外培养后，其细胞形态和功能都会发生一定程度的改变。因此对于体外培养的细胞，应该把它们视为一种既保持动物体内原细胞的一定性状、结构和功能又具有某些改变的特定细胞群体，而不能将之视为与体内相应的细胞完全等同。另外，体外长期培养的细胞，尤其是经过反复传代、长期培养者，有可能发生染色体非二倍性改变等情况。
但从总体上来说细胞培养确实是一种研究活组织和细胞的良好方法。利用这一技术，可进行多方面的研究。归纳起来，可有以下四个方面：(1) 细胞与细胞之间的相互作用。如细胞与细胞之间的粘附作用、接触抑制、细胞识别以及密度抑制等；(2) 细胞内部与细胞外界
环境之间的作用，如细胞对外界刺激的反应、药物对细胞的作用、细胞内产物的分泌等；(3) 细胞内细胞质的各种生理活动，如能量代谢以及细胞内核酸、蛋白质的合成等；(4) 细胞质与细胞核之间的物质信息流动，如RNA从细胞核到细胞质的移动、激素受体复合物的移位等。
总之，目前细胞培养仍然是细胞生物学研究方面的一项十分重要的技术，应用范围极为广泛，如病毒学、细胞免疫学、遗传学、细胞的分化与发育、肿瘤细胞学、细胞生物化学、细胞的超微结构、原生质体培养、细胞工程以及临床医学及生物技术方面的应用等方面，都需要借助于这一项技术。因此，它的发展前途是不可估量的。
第二节 培养细胞的特性
一、培养细胞的生长方式及类型
细胞离体培养时，失去了神经和体液的调节以及细胞之间广泛相互影响的制约关系，因此离体培养细胞与体内并不完全相同。体外培养的细胞，根据能否贴附于支持物上生长的性质，主要可分为贴附型和悬浮型两类：小说名句
(一) 贴附型：大多数培养细胞呈贴附生长，属于贴壁依赖性细胞。根据其形态大致可分为以下四种类型：
1. 成纤维样细胞型：细胞呈梭形或不规则的三角形，中央有卵圆形细胞核，细胞质向外伸出突起。细胞在生长时呈放射状、火焰状或漩涡状走行。由中胚层间充质起源的细胞，如心肌、平滑肌以及成骨细胞等常呈本型形态。
2. 上皮样细胞型：细胞成扁平不规则多边形，中央有圆形核。细胞彼此紧密相连形成单层膜，生长时呈膜状移动，处于上皮边缘的细胞总与膜相连，很少脱离细胞群体单独活动。起源于内、外胚层细胞如皮肤表皮及其衍生物；消化管上皮；血管内皮、肝、胰和肺泡上皮等皆属本型细胞。
3. 游走细胞型：本型细胞在支持物上散在生长，一般不连接成片，细胞质经常伸出伪足或突起，呈活跃的游走或变形运动，速度快且方向不规则。此型细胞不稳定，有时难以和其它类型的细胞相区别。
4. 多形细胞型：某些组织的细胞，如神经组织的细胞等，难以确定其规律和稳定的形态，可统归于此型。
(二) 悬浮型：见于特殊的细胞，如某些类型的癌细胞和白血病细胞，细胞形状为圆形，适于繁殖大量细胞。
(三) 贴附兼悬浮型：如B95-8和某些肿瘤细胞如SGC7901等既可呈现贴附生长，也可表现为悬浮生长。
当培养条件良好时，细胞形态上有相对的稳定性和一致性，在一定程度上反映细胞的起源，以及正常和异常(恶性)的区别，可作为细胞形态学的一个指标和依据。
二、细胞形态结构
培养细胞与体内细胞的形态相似，亦由细胞膜、细胞质和细胞核三部分组成，但大体形态与体内细胞有显著区别。
根据细胞是否贴附于支持物上生长，其形态可有以下几种不同的表现：
1. 呈悬浮状态生长时，不论原来属于哪种类型的细胞，由于生长在液体环境中，受液体表面张力的影响，所有的细胞都呈圆形。
2. 如附于支持物表面之后，开始仍为圆形，但为时甚短，经过形态过渡，逐渐恢复成原细胞形态。莫干
3. 一般在附于支持物上数分钟以后，即由球形移行成圆饼形。这种状态的细胞称为放射延展细胞(redial spread cell)，可分为两部分：A中心区(内质)中央为细胞核，核周细胞质稠密，即内质，含有各种细胞器。B板层区(外质) 是细胞质的外周部分，无色透明，包绕内质，不含细胞器，外质周边为圆形，但常有伪足伸出或回缩。
4. 经过一定时间以后，延展细胞过渡为极性细胞(polarized cell)，极性细胞可呈纺锤形、扇形、三角形或星形等多种形态，并随运动而变动。它们的外质周边有活跃与不活跃两部分：不活跃部分较稳定；活跃部分常有伪足伸出，使细胞发生定向运动。有时细胞贴附于支持物后，也可不经放射延展阶段直接变为极性细胞。
鸭绒羽绒服怎么洗 成纤维细胞形态变化过渡与上述过程基本上一致。上皮细胞略有所不同，经过延展细胞后进入极性细胞，细胞相连接嵌合成片，而且多数细胞的周边部分似乎并无活跃部与不活跃部的区别。
三、培养细胞的生长特点
(一) 粘附
细胞粘附并伸展，是多数离体培养细胞的基本生长特点。虽然血细胞如淋巴细胞在活体体内并无聚集的倾向并在体外可于悬浮状态下生长，但是大多数哺乳动物细胞在体内和体外均需附着一定的基质而生长，在体外这些基质可以是其他细胞、胶原、玻璃或塑料等。培养细胞在未贴附于基质之前一般均似球形体，一旦与基质贴附后，细胞将逐渐伸展而形成一定的形状，表现为成纤维样细胞或上皮样细胞等。细胞粘附于基质并非一种耗能的过程，但与电荷有关。据资料记载，370C时在豆豉鲮鱼炒油麦菜2min内细胞之间即可形成键，这键种可对0.01%胰蛋白酶起作用且仅发生于细胞之间，而细胞与基质之间则无，8min后才有稳定的键形成。一些特殊的促进细胞粘附的因子如基膜素、纤粘蛋白、层粘蛋白、III型胶原、血清扩展因子等，可能参与细胞的粘附过程。这些促细胞粘附因子均为蛋白质，存在于细胞膜表面或培养液或者血清之中。在培养过程中，这些带正电荷的促细胞粘附因子先吸附于底物上；悬浮的圆球形细胞再与已吸附有促细胞粘附因子的底物附着，之后细胞逐渐伸展成原来的形态。一般来说，从底物脱离下来的贴附型生长细胞，不能长期在悬浮状态下生长而逐渐退变，除非这是一些转化了的细胞或恶性肿瘤细胞。
细胞的粘附和伸展，首先底物需具备一定的条件(如促细胞粘附因子等)，另外尚受一些因素的影响，如：(1) 离子的作用，细胞粘附需要Ca2+的存在，低Ca小葱拌豆腐的做法2+ 培养液不利于细胞的伸展；(2) 机械、物理因素也可影响细胞粘附，低温或培养液流动过快均会影响细胞粘附；(3) 某些生物因素对细胞的粘附可能有影响，表皮生长因子(EGF)可刺激神经胶质细胞的皱褶活动，成纤维细胞生长因子(FGF)能减少3T3电话恐惧症细胞在底物上的扁平程度。
(二) 接触抑制及密度依赖性
接触抑制是离体培养细胞中某些贴附型细胞的生长特征之一。离体培养细胞在生长过程中通过细胞分裂而增殖。以成纤维细胞为例，一般情况下，正常细胞存在有连续的活动或和移动，其外周细胞膜呈现特征性皱褶样活动。但是当两个细胞移动而相互靠近时，其中之一个或两个都停止移动并向另一方向离开，这就保证了细胞不会相互重叠。当一个细胞被其它细胞围绕使得无处可去而发生接触时，细胞不再移动，在接触区域细胞的膜皱褶活动亦告停止，此即接触抑制(contact inhibition)。因此，一般情况下正常细胞并不会相互重叠生长，但是转化细胞或恶性细胞则接触抑制下降，细胞之间可以相互重叠生长。
正常情况下，当细胞生长、融合形成单层时，细胞变得比较拥挤，以致细胞扁平的程度
变小，与培养液接触的表面区域亦因此减少，同时培养液中的一些营养物质将逐渐消耗殆尽，尤其是紧靠细胞周围的部位，这样形成的单层细胞，分裂将逐渐停止。如3T3细胞，在细胞稀少状态下培养时，其生长速度很快，一旦细胞生长形成融合单层细胞后，细胞分裂停止，这种细胞可在静止状态下存活一段时期，但不再发生分裂增殖，其确切的细胞密度与培养液中的血清浓度有关。上述细胞的这种生长特性即为密度抑制或密度依赖性调节。转化细胞或恶性细胞则与正常细胞不同，其密度抑制常常降低，因而可以形成很高的细胞密度。
(三) 培养细胞的生长过程
