ERIC-PCR技MLST技对30株耐碳青霉烯类
肺炎克菌的基因分型结果观察
王方，吴新明，王彦，梁伟
连云港市第二人民医院，江苏连云港222000
摘要：目的采用肠杆菌基因间重复一致序列PCR(ERIC-PCR)技术与多位点序列分型技术(MLST)技术分析耐碳青霉烯类肺炎克菌菌株的基因分型，为临床用制提供依据。方法采用VITEK-2细菌分析仪检测30株青霉烯类肺炎克菌菌株对、氨等16种抗菌药的耐药性。提取30株菌株的基
组DNA，制备菌株基因组模板，扩增碳青霉烯酶基因(KPC-2、NDM-1、IMP、VIM、OXA)对扩增阳性产物进行测NCBI网站上Blast比对，确青霉烯酶耐药基因的分型。ERIC-PCR基因分型法：根据肠细菌基复序列ERIC设计引物，对30株炎克菌基因分型，运用NTSYS软件对ERIC-PCR得到的电泳图进行聚类分析。MLST基因分型法：扩增肺炎克雷伯菌的7个管家基因(rpoB、gapA、mdh、pgi、phoE、infB和tonB)片段，扩增片段测序后与数据库数据比对得出等位基因谱，从而得到相应的序列型(ST)。结果30株耐碳青霉烯类肺炎克雷伯菌菌株对氨节西林、氨节西林/舒巴坦、氨曲南、头抱他睫、头抱瞠林、头、亚胺培南、和哌拉西林/他瞠巴坦的耐药率均为100%，阿米卡星和复方新诺明的耐药率为76.6%，其他药
物的耐药性介于两者之间。30株菌均为多重耐药菌，在检测的16种药物中，耐药率介于76.6%~100%。30株菌株中25株菌KPC-2基因扩增阳性,2株NDM基因扩增阳性,1株KPC-2、NDM-1基因男株未检测到碳青霉烯酶基因。30株耐碳青霉烯酶肺炎克雷伯菌株的MLST方法分型为5个ST型，其中ST11(83.3%,25/30)、ST641(6.6%,2/30)、ST76(3.3%, 1/30)、ST392(3.3%,1/30)和ST1322(3.3%,1/30)；ERIC-PCR分型为5个谱型，分别为A型(83.3%,25/30),B 型(6.6%,2/30)、型(3.3%,1/30)、D型(3.3%,1/30)和E型(3.3%,1/30)。结论30株耐碳青霉烯类肺炎克菌菌株均为菌。ERIC-PCR MLST分型用于肺炎克雷伯菌的基因分 分辨率。
关键词：肠杆菌基复一致序列PCR；多位点分型；肺炎克菌；碳青霉烯类
抗生素；耐碳青霉烯类肺炎克菌；基性；基因分
doi：10.3969/j.issn.1002-266X.2020.30.009
中图分类号:R372文献标志码:A文章编号:1002-266X(2020)30-0035-05标识码QSID)
Performanee comparison of ERIC-PCR and MLST in genotyping of30strains
of Klebsiella pneumoniae
WANG Fang,WU Xinming,WANG Yan,LIANG Wei
Lianyungang Second People s Hospital,Lianyungang222000,China
最宝贵的话
Abstract:Objective To u enterobacterial repetitive intergenic connsus(ERIC)-polymera chain reaction (PCR)technology and multilocus quence typing technology(MLST)to analyze the genotyping of carbapenem-resistant Klebsiella pneumoniae strains,which will provide basis for the clinical medication and hospital infection control.Methods The resistance of30strains of carbapenem-resistant Klebsiella pneumoniae to amikacin,ampicillin and other16antimicrobial agents was detected by VITEK-2bacterial analyzer.The genomic DNA from30strains was extracted to prepare the genomic template,and the carbapenea genes(KPC-2,NDM-1,IMP,VIM,and OXA)were amplified and quenced.
The quences were compared by Blast on the NCBI website to determine the genotyping of carbap
enem resistance genes.
ERIC-PCR genotyping method：30strains of Klebsiella pneumoniae were genotyped by primers designed according to the common repeat quences among enterobacteria genes,and the electrophoretic patterns obtained by ERIC-PCR were clustered by NTSYS software.MLST genotyping method：ven houkeeping genes(rpoB,gapA,mdh,pgi,phoE,infB and
基金项目：江苏省自然科学基金面上项目(BK20191210)；江苏省“333工程”培养资金项目(BRA2019248)。
第一作者简介：王方(1992-)女，硕士男为临床微生物检验。E-mail：
通信作者简介：梁伟(1981-)，男，博士，副主任技师男为碳青霉烯类肺炎克菌临床播散的分子机制。E-mail：
35
tonB)fragments of Klebsiella pneumoniae were amplified and quenced and compared with the databa data to obtain the allele profile,and thus the corresponding quence type(ST)was obtained.Results Thirty carbapenem-resistant Klebsiella pneumoniae strains were resistant to ampici
llin,ampicillin/sulbactam,aztreonam,ceftazidime,cefazolin,cefepime, imipenem(Tyneng),and piracillin/tazobactam,with resistance rate of100%in each,while the resistance rates of amikacin and compound trimethoprim were76.6%，and the resistance rates of other drugs was between the two.All the30 strains were multi-drug resistant bacteria.Among the16drugs tested，the drug resistance rates ranged from76.6%to 100%.Among the30strains，25strains were positive for KPC-2gene amplification，2strains were positive for NDM gene amplification，1strain had KPC-2and NDM-1genes，and2strains did not have carbapenema genes.Thirty carbapene-ma-resistant Klebsiella pneumoniae strains were classified into5ST types by MLST method，which were ST11(83.3%，25/30),ST641(6.6%,2/30),ST76(3.3%,1/30),ST392(3.3%,1/30),and ST1322(3.3%,1/30)；there were also five spectral types of ERIC-PCR typing,including type A(83.3%,25/30),type B(6.6%,2/30),type C(3.3%, 1/30),type D(3.3%,1/30),and type E(3.3%,1/30).Conclusion All30carbapenem-resistant Klebsiella pneumoniae strains are multi-drug resistant;ERIC-PCR and MLST have the same resolution in genotyping of Klebsiella pneumoniae.
Key words:enterobacterial repetitive intergenic connsus-polymera chain reaction；multilocus quence typing；klebsiella pneumoniae;carbapenems;carbapenem-resistant Klebsiella pneumoniae;gene homology;genotyping
肺炎克雷伯菌（Klebsiella pneumonia,KP）是一-种常见的临床致病菌，可导致院内感染和社区获得性感染，老年人、手术患者及长期使用抗生素的患者为肺炎克雷伯杆菌的易感人群⑴。碳青霉烯类抗菌药具有稳定性好、抗菌谱广等优点，是临床治疗肺炎克雷伯菌感染的最有效药物，也是最后一道防线［,3］。随着抗生素药物广泛使用，耐碳青霉烯类肺炎克雷伯菌作为一种多重耐药病菌株不断涌现，导致临床上治疗肺炎克雷伯菌感染患者的无效率超过了半数⑷。耐碳青霉烯类肺炎克雷伯菌给临床抗感染治疗带来了巨大挑战。对肺炎克雷伯菌进行同源性分析是研究其感染状况、耐药机制以及流行病学研究的重要工具。因此建立快速准确的同源性分析方法极为重要。肠杆菌基因间重复一致序列PCR（ERIC-PCR）是根据ERIC的核心序列设计引物,PCR扩增两个ERIC之间序列，不同细菌的ERIC序列在染色体的位置不一样，因此可以根据扩增条带位置和数量来判断是否为同一基因型多位点序列分型。多位点序列分型（MLST）是一种基于管家基因核酸序列测定的细菌分型方法，既适于分子流行病学调查，也可用于细菌的分子进化研究。目前关于ERIC-PCR、MLST在耐碳青霉烯类肺炎克雷伯杆菌基因分型方面的研究较少。因此，我们分别采用ERIC-PCR和MLST法对30株耐碳青霉烯类肺炎克雷伯菌进行基因分型，并比较两种方法的基因分型结果。现报告如下。
1材料与方法
1.1菌株来源、试剂及仪器选择2017年1月~ 2018年12月间连云港市第二人民医院分离的30株耐碳青霉烯类肺炎克雷伯菌菌株标本，主要来源36于重症监护室、脑血管外科和呼吸内科等；标本类型分为痰
及支气管分泌物（53.3%）、尿液（23.3%）、血液（13.3%、、切口分泌物（10%）o30株菌株中没有同一患者的重复分离株。PCR仪（Applied Biosystems，美国）；电泳仪和凝胶成像仪（北京六一公司）；VITEK-2全自动细菌分析仪（法国生物梅里埃生物有限公司）；DNA Marker购自天跟生化有限公司；PCR Mix购自LABLEAD；相关扩增引物和测序由杭州有康生物技术有限公司合成。
1.2耐碳青霉烯类肺炎克雷伯菌对抗菌药物的耐药情况观察采用药敏试验。采用VITEK-2细菌分析仪观察30株耐碳青霉烯类肺炎克雷伯菌株对阿米卡星、氨节西林、氨节西林/舒巴坦、氨曲南、头抱他睫、头抱卩坐林、环丙沙星、头抱曲松（菌必治）、头抱替坦、头抱毗月亏、庆大霉素、亚胺培南（泰能）、左氧氟沙星、哌拉西林/他坐巴坦、复方新诺明、妥布霉素等16种抗菌药物的耐药性，结果根据美国临床实验室标准化研究所2015版标准进行判断。
1.3耐碳青霉烯类肺炎克雷伯菌的基因分型
1.3.1制备菌株基因组模板采用煮沸法提取30株菌株的基因组DNA。首先挑取分纯后的2~3个单菌落于含有200p L无菌水的EP管中混匀, 100°C加热10min,12000r/min离心10min，所得上清即可作为后续PCR反应的模板。
1.3.2碳青霉烯酶基因的扩增利用PCR技术扩增30株菌株基因组DNA中的碳青霉烯酶基因，包括KPC-2、NDM-1、IMP、VIM、OXA，引物序列参照相关文献设计［5］（表1），由杭州有康生物公司合成。
扩增体系为25p L，包括2x PCR Master Mix 1
2.5p L、10p mol/L上游引物和下游引物各加入
1p L、DNA模板2p L，加无菌超纯水至25p L。反应条件为94C预变性5min；94C变性30s,55C 退火1min,72C延伸40min，循环30次，最后72C 延伸10min o对扩增结果阳性产物进行测序(杭州有康生物公司)，所得序列在NCBI网站上进行Blast 比对分析。从而确定碳青霉烯酶耐药基因的分型。
表1碳青霉烯酶基因的扩增引物序列
基因名称引物序列(5'-3‘)产物长度(bp)
KPC-2TGCTTGTCATCCTTGTTA
TAGTTCTGCTGTCTTGTC
796
IMP CATGGTTTGGTGGTTCTTGT
ATAATTTGGCGGACTTTGGC
488
NDM-1ATTAGCCGCTGCATTGAT
ATTAGCCGCTGCATTGAT
241
VIM GATGGTGTTTGGTCGCATA
CGAATGCGCAGCACCAG
865
OXA TTTTCTGTTGTTTGGGTTTT
TTTCTTGGCTTTTATGCTTG
519
1.3.3基分法
1.3.1MLST分型方法肺炎克雷伯菌的7个管家基因序列、引物序列及分型都参照巴斯德研究院的推荐，网址https：//bigsdb.pasteur.fr/klebsiella/ klebsiella.html,7个管家基因分别为gapA,infB, mdh、pgi、phoE、rpoB、tonB。PCR反应体系为30p L，包含15p L2x PCR Mix、上引和下引各1.5p L, 2p L模板DNA和10p L无菌超纯水。反应条件为94C预性5min,94C性30s,60C1min, 72C40min，循环30,72C
10min。扩增片段测序后与数据库数据比对得出等位基因谱，从而得到相应的序列型。
1.3.2ERIC-PCR分型方法根据肠细菌基因间共有重复序列ERIC设计引物ERIC-F(5'-ATGT AAGCTC CTGGGGATTCAC-3')、ERIC-R(5'-AAG-TAAGTGACTGGGGTGAGCG-3')。PCR体为20p L，包含10p L2xPCR Mix.ERIC-F和ERIC-R 各1p L男p L模板DNA和6p L无菌超纯水。反应条为94C预性5min；94C性45s,44C 1min,65C4min，循环30,65C观音菩萨坐骑
伸16min。运用NTSYS软件对ERIC-PCR电泳图进行聚类分析，聚类树状图相似系数(SI)>90%，且无明显条带差异定为同一基因型。
2结果
2.130株耐碳青霉烯类肺炎克雷伯菌菌株对16种抗菌药物的敏感率、中介率及耐药率比较30株耐碳青霉烯类肺炎克雷伯菌菌株对氨节西林、氨节西林/舒巴坦、氨曲南、头抱他睫、头抱卩坐林、头抱毗月
亏、亚胺培南(泰能)、和哌拉西林/他卩坐巴坦的耐药率均为100%，阿米卡星和复方新诺明的耐药率为76.6%，其他药物的耐药性介于两者之间。结果见
2。
表230株耐碳青霉烯类肺炎克雷伯菌菌株对16种抗菌
药物的敏感率、中介率及耐药率比较
抗菌药物敏感率中介率率
阿米卡星23.4%076.6%
氨节西林00100.0%
氨节西林/舒巴坦00100.0%
氨曲南00100.0%
头抱他喘00100.0%
头抱坐林00100.0%
环丙沙星 3.3% 6.7%90.0%
头抱曲松(菌必治) 3.3%096.7%
头 3.3% 6.7%90.0%
头00100.0%
庆大霉素13.3% 6.7%80.0%
亚胺培南(泰能)00100.0%
左氧氟沙星10.0%090.0%
哌拉西林/他坐巴坦00100.0%
复方新诺明23.4%076.6%霉20.0%080.0%
2.2青霉类炎克菌的青霉基
因扩增结果30株菌株中,5株菌KPC-2基因扩
增阳性,2株NDM基因扩增阳性，1株KPC-2、NDM-
1基因扩增阳性,2株未检测到碳青霉烯酶基因。2.3ERIC-PCR分型结果ERIC-PCR指纹图谱结
果扩增条带清晰，数目为5~12条，产物最长的超过
2000bp，的于100bp。类状结果
可将30株菌株分为5个谱型，分别为以A型
(83.3%,25/30)男型(6.6%,2/30)、C型(3.3%, 1/30)、D型(3.3%,1/30)和左型(3.3%,1/30) 2.4MLST分结果30株菌分为5种 ST
型，分别ST11(83.3%)、ST76(3.3%),ST392 (3.3%)、ST641(6.6%)和ST1322(3.3%)。在30
株菌中ST11型占绝对优势，分布较集中，克隆株相
对。
2.5ERIC-PCR与MLST分型结果的比较30株菌
当中的1、2、3、4、6、7、8、9、10、12、13、14、15、16、17、
18、19、20、21、22、23、24、25、26,27号在ERIC-PCR
分型系统中属于A型，在MLST分型结果当中属于
ST11；29、30号菌在两种分型方法当中分别属于B
型和ST64；5号菌分别属于C型和ST1322；11号菌
分别属于D型和ST392；28号菌分别属于D型和
ST64。两种方法对于30株菌的分辨率完全相同。
3讨论
肺炎克雷伯菌是医院内重要的条件致病菌之一，可引起呼吸系统、血液系统、泌尿系统及消化系统等感染⑷。近年来由于抗菌药物的广泛应用，耐碳青霉烯类革兰阴性杆菌数量逐年增加⑺8］。在本30株炎克菌的性结果
37
包括亚胺培南在内的16种抗菌药物耐药率均大于70%，其中对头抱他睫、头抱卩坐林、氨节西林、氨
曲南、氨节西林/舒巴坦、亚胺培南、头抱毗月亏和哌拉西林/他坐巴坦的耐药率可达100%，说明其耐药性非常严重。而我院存在肺炎克雷伯菌感染的患者病死率达到了48.7%，高致死率可能与患者具有基础性疾病或并发症相关。因此，快速准确地进行临床分离菌株的同源性分析，避免院内感染在更大范围内暴发具有的意义。
判断医院内是否发生感染的一种重要的方法就是比较同一时期分离菌株之间的同源性。目前，常用的同源性分析方法有很多，主要包括核糖体分型(Ribotyping)、随机扩增PCR(Random amplified polymorphic DNA,RAPD)、限制性片段长度多态性(Re-striction fragment length polymorphism,RFLP)、MLST、脉冲场凝胶电泳(Puld field gel electrophore,PF-GE)和ERIC-PCR等［J0］。其中MLST技术是通过扩增细菌基因组中的7个管家基因片段，将获得的序列数据与数据库进行比对，每个管家基因序列都将获得一个唯一的等位基因号,7个等位基因号组合成为唯一的MLST型别［1］。MLST实验结果已经能够标准化和数字化，因此该技术具有较高的分辨率和重复性。是目前国际上公认的最为客观的同源性分析方法［2］。
ERIC-PCR技术是在90年代开始由sharples和HuIton等建立的一种用于细菌同源性分析的一种技术［3］。该方法根据肠细菌基因间一段高度保守的共有重复序列设计引物，根据扩增所获得的电泳图结果来判断不同菌株之间的同源性［14,15］。肠杆菌科基因间重复序列(ERIC)是一段长度为126bp序列，位于染色体的非编码区，核心区域有一段具有高保守性的复。ERIC的核
设计引物，采用PCR的方法扩增两个ERIC之间的序列。不同细菌的ERIC序列在染色体的位置不一样，因此可以根据扩增条带位置和数量来判断是否为同一基因型［6，"］。该方法具有操作简单、成本低和周期短等优点，适用于大批量样本的流行病学调查［8］。Qing等［19］利用MLST和ERIC-PCR两种方法对700株大肠杆菌进行了同源性的分析，得出两种方法具有相同的分辨率。苏珊珊等［20］对从重症监护室分离出了16株碳青霉烯类耐药肺炎克雷伯菌进行基因分型,ERIC-PCR检测为同一型别，MLST
结果显示均为ST76型，这表明两种分型方法得出的结果。
本研究对分离的30株耐碳青霉烯类肺炎克雷伯菌进行ERIC-PCR和MLST基因分型，结果显示ERIC-PCR可以将30株菌分为5个基因型，分别为A~E型，其中以A型为主，占总数的83.3%，其它四种类型共占16.7%。MLST结果表明,30株菌仍可以分为5个基因型，分别为ST11、ST641、ST76、ST392和ST1322，其中ST11占83.3%，其它四种类型共占16.7%。本研究中的30株耐碳青霉烯类的炎克菌ST分明的分点，其中ST11型占据绝对优势。据报道uXSTn型克隆株主要在中国、韩国、新加坡等亚洲国家流行。而在美国和欧洲等国家耐药的肺炎克雷伯菌主要的流行株为ST258型［2］。ST11型与ST258型菌株具有很高的同源性，两者仅有tonB这个管家基因序列不同，其余6个管家基因序列完全一致。据报道ST258型菌基因组中含有一段特殊的区域，该区域与荚膜多糖的合成有关，可以帮助细菌逃避宿主免疫系统的攻击，从而使其更易传播⑴加。但是目前关于ST11和ST258如何成为优势克隆
株的确切机制仍然不清晰，有待进一步研究。
PCR扩增结果显示共检测到2种碳青霉烯酶基因，分别为KPC-2和NDM-1o其中，KPC-2型碳青霉烯酶基因共检出26株，占总数的86.7%, NDM-1检3株，数的10%。
blaKPC-2blaNDM-1基肠菌科细菌
要的耐药性碳青霉烯酶基因，其中blaKPC-2是肺炎克雷伯菌中最常见的碳青霉烯酶基因［5］。自从blaKPC-2基因发现以来，各国均有产KPC型耐药性的肺炎克雷伯菌流行的报道，我国多地也报道［26］了产KPC-2型肺炎克雷伯菌，并已成为我国肺炎克雷菌的。
本实验对ERIC-PCR和MIST两种分型方法进行比较,ERIC-PCR得到的5个谱型分别对应MLST 的5种ST序列型，因此，可以得出两种分型方法在炎克菌的基分结果，明两的分辨率相同。30株菌均具有相同的ERIC-PCR型和ST型，说明这两种方法在肺炎克雷伯菌基因分型的分率。MLST基于对个管家基
分析的分子分型技术，菌株同源性分析结果更加保守，适用于长时间跨度、大范围的分子流行病学研究。但MLST实验过程中需要对管家基因序列进行测序，价格昂贵，而且工作量大，要推广到每个实验室有一定的难度［7］。而ERIC-PCR具有灵敏度高、分辨率高、稳定性高、重复性好、的特点，又有操作简单、成本低、检测快捷、无需特殊仪器的优势，易于在临床上推广，近年来被广泛应用于细菌鉴定及基因
计划任务
38
分型研究。
综上所述,0株耐碳青霉烯类肺炎克雷伯菌菌株均为多重耐药菌。ERIC-PCR与MLST分型用于肺炎克雷伯菌基因分型中分辨率相同，ERIC-PCR 具有灵敏度高、分辨率高、稳定性高、重复性好、的特点，又有操作简单、成本低、检测快捷、无需特殊仪器等优点，易于在临床上推广，可用于耐碳青霉烯类肺炎克雷伯军细菌的鉴定及基因分型研究。
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(收稿日期：2020-005-07)
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